miR-186對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控及機(jī)制研究

劉 洋,高長(zhǎng)俊

1.河北省保定市第二中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北保定 072650;2.河北省唐山市婦幼保健院小兒血液科,河北唐山063000

急性髓系白血病發(fā)病時(shí)原始髓樣細(xì)胞出現(xiàn)異常增生,抑制了正常細(xì)胞的造血功能,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。臨床上通常采用化療的方法來(lái)治療急性髓系白血病,但存在藥物的不良反應(yīng)及藥物耐藥等問(wèn)題。因此,探索安全、有效的新方法對(duì)治療急性髓系白血病的意義重大。

微小RNA(miRNA)是一種小分子RNA,有多項(xiàng)研究在宮頸癌、前列腺癌等多種癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)miRNA家族在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[2-6]。研究表明miRNA能夠影響血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,在調(diào)控人體造血過(guò)程中具有非常重要的作用[7-8]?，F(xiàn)已證實(shí)miRNA在包括急性髓系白血病在內(nèi)的血液腫瘤中具有原癌基因或抑癌基因的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通過(guò)磷酸化激活絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)進(jìn)而對(duì)下游的多種靶分子的活性產(chǎn)生影響。PI3K/AKT通路參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移等過(guò)程[9]。關(guān)于PI3K/AKT通路介導(dǎo)急性髓系白血病前人也有研究[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道,在肺腺癌中,miRNA-186(miR-186)參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移是通過(guò)介導(dǎo)PI3K/AKT通路完成的[11-12]。但關(guān)于miR-186介導(dǎo)PI3K/AKT通路調(diào)控人原髓細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞增殖、遷移等過(guò)程的作用機(jī)制尚未明確。因此,本研究通過(guò)研究miR-186調(diào)控PI3K/AKT通路在HL-60細(xì)胞增殖、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中的作用,為研究急性髓系白血病提供新的理論依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 HL-60細(xì)胞購(gòu)自北納生物;PI3K/AKT通路抑制劑(LY294002)、PI3K/AKT通路激活劑(SC79)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%,貨號(hào)為S43088、S80614;miR-186、陰性對(duì)照片段(mimic NC)由上海生工公司進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成;Lipofectamine 2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,貨號(hào)為C0075S;5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司,貨號(hào)為P0013B;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,貨號(hào)為RR820A;鼠抗人磷酸化(p)-PI3K購(gòu)自上海戶實(shí)公司,貨號(hào)為HK5745;鼠抗人PI3K貨號(hào)為10017175,鼠抗人AKT貨號(hào)為10022173,p-AKT貨號(hào)為10022023,N-鈣黏蛋白(N-cadherin)貨號(hào)為10010628,E-鈣黏蛋白(E-cadherin)貨號(hào)為1004426,波形蛋白(Vimentin)貨號(hào)為10017978,纖維粘連蛋白(FN)貨號(hào)為10016772,肌動(dòng)蛋白(β-actin)貨號(hào)為10021787,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)貨號(hào)為20000425且均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。 HF151型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司;DMI1型光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;Multiskan Ascent型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;ZF-288型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1HL-60細(xì)胞培養(yǎng) HL-60細(xì)胞株大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)接種于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中,并置于濕度為70%～80%,溫度為37 ℃,含5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),更換培養(yǎng)液間隔時(shí)間為2 d,選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HL-60細(xì)胞,按照不同干預(yù)內(nèi)容分為5組(對(duì)照組,mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組)。對(duì)照組不做處理;mimic NC組采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將mimic NC轉(zhuǎn)染于HL-60細(xì)胞(轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h);miR-186組將miR-186 轉(zhuǎn)染于HL-60細(xì)胞(轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h);miR-186+抑制劑組和miR-186+激活劑組細(xì)胞處理方法為轉(zhuǎn)染miR-186于HL-60細(xì)胞(轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h)后,分別加入LY294002和SC79,使其最終水平均達(dá)到10 μmol/L,干預(yù)24 h,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3檢測(cè)miR-186及EMT相關(guān)因子相對(duì)表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)HL-60細(xì)胞中miR-186相對(duì)表達(dá)水平及EMT相關(guān)因子(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、FN)信使核糖核酸(mRNA)相對(duì)表達(dá)水平,參照試劑盒的說(shuō)明書(shū),提取總RNA,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,隨后進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。測(cè)定miR-186相對(duì)表達(dá)水平時(shí)以U6作為管家基因,測(cè)定EMT相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平時(shí)以GAPDH作為管家基因。采用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-186及EMT相關(guān)因子的引物序列

1.2.4EdU法測(cè)定HL-60細(xì)胞的增殖率 將轉(zhuǎn)染24 h后的HL-60細(xì)胞進(jìn)行EdU孵育2 h,固定30 min,加入0.3% TritonX-100表面活性劑透化10 min;在每孔中加入100 μL Click反應(yīng)液避光孵育30 min,再進(jìn)行常規(guī)的Hoechst復(fù)染;裝片后,觀察并采集在熒光顯微鏡下的EdU紅色熒光信號(hào)和Hoechst 33342藍(lán)色熒光信號(hào),采用ImageJ V1.8.0軟件確定細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞增殖率為EdU陽(yáng)性染色細(xì)胞(紅色)占總細(xì)胞(藍(lán)色)的百分比。

1.2.5Transwell小室法測(cè)定HL-60細(xì)胞的遷移能力 將轉(zhuǎn)染后的HL-60細(xì)胞接種到24孔板Transwell小室中,加入無(wú)血清的細(xì)胞懸液,并在下室中加入含10% FBS的RPMI-l640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,收集下室懸液,細(xì)胞濃縮計(jì)數(shù),然后置于顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù),遷移率=(遷移終點(diǎn)細(xì)胞數(shù)-遷移起點(diǎn)細(xì)胞數(shù))/遷移起點(diǎn)細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6蛋白免疫印跡法檢測(cè)HL-60細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路及EMT相關(guān)因子及表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞24 h后,采用RIPA裂解液重懸并裂解;在4 ℃條件下,以12 000 r/min離心10 min,然后收集上清液,即總蛋白樣品。將蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳(80～120 V恒壓法),再采用電泳法(300 mA恒流法)進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜,利用脫脂牛奶法進(jìn)行膜封閉,在4 ℃條件下進(jìn)行一抗孵育過(guò)夜;室溫二抗孵育2 h。封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影之間分別用Tris洗膜緩沖液進(jìn)行3～5次膜洗滌。在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行圖片采集,并用ImageJ V1.8.0軟件進(jìn)行蛋白灰度分析,內(nèi)部參考為β-actin,并進(jìn)行目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.15組miR-186相對(duì)表達(dá)水平比較 對(duì)照組、mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組的miR-186相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.17、1.01±0.19、1.85±0.14、1.85±0.14、1.82±0.15。5組間miR-186相對(duì)表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.783,P<0.05);與mimic NC組相比,miR-186組miR-186表達(dá)水平升高(t=6.463,P<0.05)。miR-186組與miR-186+抑制劑組和miR-186+激活劑組的miR-186相對(duì)表達(dá)水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.023、0.231,P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 5組miR-186相對(duì)表達(dá)水平

2.25組HL-60細(xì)胞的增殖率比較 對(duì)照組、mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組細(xì)胞增殖率分別為(58.63±3.36)%、(59.07±3.69)%、(34.6±2.23)%、(20.53±1.86)%、(57.5±2.91)%。5組HL-60細(xì)胞的增殖率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=111.339,P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組細(xì)胞增殖率降低(t=10.364,P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組細(xì)胞增殖率降低(t=5.959,P<0.05),而miR-186+激活劑組細(xì)胞增殖率升高(t=9.699,P<0.05)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 5組HL-60細(xì)胞增殖情況

圖3 5組HL-60細(xì)胞增殖率

2.35組HL-60細(xì)胞的遷移率比較 對(duì)照組、mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組細(xì)胞遷移率分別為(21.00±2.09)%、(20.88±2.53)%、(9.73±0.44)%、(6.03±0.45)%、(20.88±2.43)%。5組HL-60細(xì)胞的遷移率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.332,P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組細(xì)胞遷移率降低(t=7.391,P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組細(xì)胞遷移率降低(t=2.453,P<0.05),而miR-186+激活劑組細(xì)胞遷移率升高(t=7.391,P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 5組HL-60細(xì)胞遷移率

2.45組HL-60細(xì)胞中EMT相關(guān)因子及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 5組HL-60細(xì)胞中EMT相關(guān)因子及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組E-cadherin及其 mRNA表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN及其mRNA表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組E-cadherin 及其mRNA表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與miR-186組相比,miR-186+激活劑組E-cadherin 及其mRNA表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表2、3。

圖5 HL-60細(xì)胞中EMT相關(guān)因子的表達(dá)

表2 5組HL-60細(xì)胞中EMT相關(guān)因子相對(duì)表達(dá)水平比較

表3 5組HL-60細(xì)胞中EMT相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.55組HL-60細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較 5組HL-60細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-186+激活劑組p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖6。

圖6 HL-60細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表4 5組HL-60細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

急性髓系白血病屬于髓系增生性腫瘤,具有克隆性髓系祖細(xì)胞分化為成熟血細(xì)胞過(guò)程中受抑制及多系細(xì)胞減少的典型特征,特點(diǎn)是高異質(zhì)性、高病死率。因而研究急性髓系白血病相關(guān)分子機(jī)制對(duì)該疾病治療意義重大[13-14]。miRNA參與多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為過(guò)程。在真核生物中由于miRNA表達(dá)水平穩(wěn)定且易檢測(cè),越來(lái)越多的miRNA逐漸成為判斷急性髓系白血病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后等方面的標(biāo)志物。有研究表明,miRNA家族成員之一的miR-186,參與靶向調(diào)控多種基因,在胃癌、非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌等不同腫瘤中miR-186表達(dá)水平均下降,miR-186參與抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等過(guò)程[15-17]。CUI等[18]研究表明,miR-186能夠在非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到抑制作用。在慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病患者中miR-186表達(dá)水平下降[19]。但具體關(guān)于miR-186與急性髓系白血病作用機(jī)制的報(bào)道較少見(jiàn)。本研究結(jié)果顯示,miR-186組HL-60細(xì)胞增殖率和遷移率低于mimic NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示miR-186對(duì)HL-60細(xì)胞有抑制增殖和遷移的作用,說(shuō)明miR-186可有效抑制急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展,這一結(jié)果也與miR-186在前列腺癌中的表達(dá)結(jié)果相似[20]。

PI3K/AKT通路在腫瘤細(xì)胞發(fā)生進(jìn)程中具有重要調(diào)控作用,激活PI3K/AKT通路,可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。DONG等[15]在軟骨細(xì)胞中的研究顯示miR-186可以調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路,付民等[11]在肺腺癌中的研究也同樣顯示腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移受miR-186激活PI3K/AKT通路的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-186組p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平低于mimic NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示miR-186過(guò)表達(dá)可以顯著降低HL-60細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平,這與高平章等[21]對(duì)PI3K/AKT通路與HL-60細(xì)胞的研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn),miR-186+抑制劑組HL-60細(xì)胞增殖率、遷移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平低于miR-186組,miR-186+激活劑組HL-60細(xì)胞增殖率、遷移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平高于miR-186組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示隨著PI3K/AKT通路抑制劑的加入,HL-60細(xì)胞增殖率、遷移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平降低,而加入PI3K/AKT通路激活劑后,則與抑制劑組有相反的趨勢(shì),表明HL-60細(xì)胞進(jìn)程受抑制的作用機(jī)制與miR-186對(duì)PI3K/AKT通路的阻遏有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)EMT獲得間質(zhì)表型進(jìn)而具備轉(zhuǎn)移能力等參與腫瘤進(jìn)程[22],EMT的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,多種信號(hào)通路涉及其中,如核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、PI3K/AKT、Janus激酶2(JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)等。miRNA在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起重要作用。李京輝等[23]在對(duì)胰腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)miR-490-3p可以通過(guò)抑制EMT進(jìn)程,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。ZHOU等[24]研究表明,miR-148a-3p可以通過(guò)調(diào)控EMT進(jìn)而抑制急性髓系白血病的進(jìn)程。腫瘤細(xì)胞惡性增殖及遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因,而腫瘤細(xì)胞EMT則是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志。本研究中,miR-186組E-cadherin及其 mRNA表達(dá)水平高于mimic NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達(dá)水平低于mimic NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-186+抑制劑組E-cadherin 及其mRNA表達(dá)水平高于miR-186組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達(dá)水平低于miR-186組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-186+激活劑組E-cadherin 及其mRNA表達(dá)水平低于miR-186組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達(dá)水平高于miR-186組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示miR-186抑制了HL-60細(xì)胞EMT進(jìn)程,在加入PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑后,E-cadherin及其mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高,N-cadherin、Vimentin、FN及其mRNA表達(dá)水平降低,而激活劑組則與抑制劑組有相反的趨勢(shì)。這說(shuō)明miR-186通過(guò)阻遏PI3K/AKT信號(hào)通路抑制HL-60細(xì)胞EMT進(jìn)程,從而影響HL-60細(xì)胞的增殖與遷移,這與付民等[11]在肺腺癌中的研究結(jié)果相似,揭示miR-186能夠通過(guò)阻遏PI3K/AKT通路來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的EMT,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述,miR-186過(guò)表達(dá)可通過(guò)阻遏PI3K/AKT信號(hào)通路,抑制HL-60細(xì)胞EMT,進(jìn)而抑制HL-60細(xì)胞增殖和遷移,本研究為以miR-186為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新藥治療急性髓系白血病提供理論基礎(chǔ),但miR-186對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖、遷移及EMT進(jìn)程影響是否與其他機(jī)制有關(guān)需進(jìn)一步深入研究。