長鏈非編碼RNA LINC02321在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其臨床意義

姚寶林,張蓓蕾,岳 娟,徐妮妮,姚君誠,榮偉程,楊 瀟△

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西西安710038;2.甘肅省通渭縣中醫(yī)醫(yī)院普通外科,甘肅定西 743399;3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射科,陜西西安710038

子宮內(nèi)膜癌(UCEC)作為最嚴(yán)重的婦科惡性腫瘤之一,占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1]。UCEC起源于子宮內(nèi)膜上皮,主要受雌激素的影響[2]。由于肥胖和老齡化人口的增加,UCEC的發(fā)病率和病死率逐年升高[3-4]。盡管近年來醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步,但由于UCEC早期診斷困難和較高的復(fù)發(fā)率,晚期UCEC患者的總體預(yù)后并無明顯改善[5-6],因此,迫切需要闡明UCEC發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制,進(jìn)而開發(fā)用于UCEC早期診斷、預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類缺乏蛋白編碼活性的RNA分子,轉(zhuǎn)錄本長度均在200個(gè)核苷酸以上,可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳學(xué)層面調(diào)控基因表達(dá)[7-8]。有研究表明,lncRNA作為關(guān)鍵調(diào)控因子可廣泛參與包括UCEC在內(nèi)的各類腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。近年來,大量lncRNAs被鑒定出在UCEC中異常表達(dá)且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān),其可通過影響細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成及耐藥等生物學(xué)過程進(jìn)而參與UCEC發(fā)生與發(fā)展[11-15],有成為診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的潛力。

LINC02321是一條轉(zhuǎn)錄于編碼基因TTC7B和RPS6KA5之間的lncRNA,位于人類染色體14q32.11區(qū)域。最近一項(xiàng)有關(guān)膀胱癌的研究發(fā)現(xiàn),LINC02321作為血管新生相關(guān)lncRNA,在膀胱癌中上調(diào)表達(dá),是膀胱癌患者預(yù)后的影響因素,并可通過激活VEGFA通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和順鉑耐藥[16],提示LINC02321在腫瘤進(jìn)展中可能發(fā)揮促癌作用。而LINC02321在UCEC中的表達(dá)是否異常及有何臨床意義目前尚不清楚。因此,本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)解析LINC02321在UCEC組織中的表達(dá)情況及其臨床意義,以期為LINC02321用于UCEC早期診斷、預(yù)后判斷等基礎(chǔ)及臨床轉(zhuǎn)化研究提供參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中552例UCEC組織和35例癌旁組織(其中23例樣本為配對組織)樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)及對應(yīng)的臨床資料作為研究對象(552例UCEC樣本中部分資料不全)。其中表達(dá)譜數(shù)據(jù)通過R語言軟件包“EdgeR”進(jìn)行過濾和標(biāo)準(zhǔn)化處理進(jìn)而獲得每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本(TPM)數(shù)據(jù),并經(jīng)log2轉(zhuǎn)換后用于后續(xù)分析。552例UCEC患者中年齡≤60歲207例,>60歲344例;臨床分期:Ⅰ和Ⅱ期393例,Ⅲ和Ⅳ期159例;初始治療結(jié)局:疾病進(jìn)展和疾病穩(wěn)定26例,部分緩解和完全緩解456例;組織學(xué)類型:子宮內(nèi)膜樣411例,混合性和漿液性141例;組織學(xué)分級:G1期99例,G2和G3期444例;殘瘤分級:R0級377例,R1和R2級38例;腫瘤浸潤程度:<50% 261例,≥50% 215例;絕經(jīng)狀態(tài):絕經(jīng)前期35例,圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期472例;激素治療:無299例,有47例。

1.2方法 (1)分析LINC02321在UCEC組織中的表達(dá)及比較其臨床病理特征。采用R語言軟件包“EdgeR”分析LINC02321在552例UCEC組織和35例癌旁組織及23例配對UCEC組織中的表達(dá)情況;基于表達(dá)水平中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,比較兩組年齡、臨床分期、初始治療結(jié)局、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級、殘瘤分級、腫瘤浸潤程度、絕經(jīng)狀態(tài)、激素治療等臨床參數(shù)的相關(guān)性。(2)分析LINC02321與UCEC患者預(yù)后相關(guān)性。基于表達(dá)水平中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,分析LINC02321表達(dá)水平與總生存期(OS)、疾病相關(guān)生存期(DSS)及無進(jìn)展間隔期(PFI)的相關(guān)性并評估生存差異。(3)分析LINC02321與UCEC免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。分析LINC02321表達(dá)水平與腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性。(4)分析LINC02321對UCEC的診斷價(jià)值。(5)LINC02321在UCEC組織中的表達(dá)驗(yàn)證。收集20例2019年1月至2022年10月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(以下簡稱本院)進(jìn)行手術(shù)切除的UCEC患者的腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本,所有標(biāo)本均經(jīng)組織RNA保護(hù)液(德國QIAGEN)處理后于—80 ℃保存。采用TRIzol試劑(美國Thermo)提取組織總RNA,并使用UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit(康為世紀(jì)生物科技股份有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析LINC02321在UCEC組織中的表達(dá)水平。qRT-PCR采用β-Actin作為內(nèi)參并通過2—ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。引物由上海生工生物工程公司合成,序列如下:LINC02321(上游引物:5′-GGAGATGAGGACTGGGAGGT-3′和下游引物:5′-GGACAGCTGGGAAAGGAGTC-3′);β-Actin(上游引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′和下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′)。本研究所收集樣本均經(jīng)患者或家屬同意,并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批號:202108-01)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件和R4.2.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。使用R語言軟件包“rms”構(gòu)建Nomogram預(yù)測模型和校準(zhǔn)曲線用于預(yù)測UCEC患者1、3和5年的OS。使用R語言包“Survival”通過 Kaplan-Meier法分析LINC02321表達(dá)水平與OS、DSS及PFI的相關(guān)性并執(zhí)行l(wèi)og-Rank檢驗(yàn)以評估生存差異;構(gòu)建Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響OS的危險(xiǎn)因素;通過“GSVA”R語言包利用ssGSEA算法解析LINC02321表達(dá)水平與腫瘤組織免疫細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性,并采用Spearman相關(guān)對LINC02321表達(dá)水平與UCEC免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性進(jìn)行評估。采用R語言軟件包“pROC”繪制受試者工作特征(ROC)曲線,通過計(jì)算曲線下面積(AUC)評價(jià)LINC02321對UCEC的診斷效能。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示,非參數(shù)兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1LINC02321在UCEC組織和癌旁組織表達(dá)情況比較 對552例UCEC組織和35例癌旁組織的表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),UCEC組織LINC02321表達(dá)水平[0.491(0.276,0.812)]高于癌旁組織[0.059(0.000,0.134)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步對23例配對UCEC組織的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),與癌旁組織[0.053(0.000,0.148)]比較,LINC02321在腫瘤組織[0.667(0.456,0.831)]中的表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2不同臨床病理特征UCEC患者LINC02321低表達(dá)與高表達(dá)情況比較 UCEC患者不同年齡、臨床分期、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級、腫瘤浸潤程度及激素治療的LINC02321低表達(dá)及高表達(dá)情況比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而初始治療結(jié)局、殘瘤分級及絕經(jīng)狀態(tài)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征UCEC患者LINC02321低表達(dá)與高表達(dá)情況比較[n(%)]

2.3LINC02321表達(dá)與UCEC患者生存期的相關(guān)性及OS影響因素的Cox回歸分析 單因素Cox回歸分析顯示,UCEC患者不同年齡、臨床分期、初始治療結(jié)局、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級、殘瘤分級、腫瘤浸潤程度及LINC02321表達(dá)水平是影響UCEC患者OS的因素(P<0.05)。見表2。LINC02321高表達(dá)患者的OS、DSS和PFI均明顯短于低表達(dá)患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。以生存狀態(tài)為因變量(死亡=0,存活=1),將表2中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且與OS相關(guān)的臨床參數(shù)作為自變量,納入多因素Cox回歸分析(賦值見表3),結(jié)果顯示,LINC02321高表達(dá)水平(HR=1.848,P=0.036)、臨床分期Ⅲ和Ⅳ(HR=3.206,P<0.001)、疾病進(jìn)展和疾病穩(wěn)定(HR=0.260,P<0.001)是影響UCEC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

圖1 UCEC患者的不同LINC02321表達(dá)的OS、DSS和PFI比較

表2 不同病理特征UCEC患者中位OS情況比較

表3 自變量賦值

表4 影響UCEC患者OS的多因素Cox分析

綜合LINC02321表達(dá)水平、年齡、臨床分期、初始治療結(jié)局、組織學(xué)分型、組織學(xué)分級及腫瘤浸潤程度等影響OS的危險(xiǎn)因素構(gòu)建Nomogram預(yù)測模型,對UCEC患者1、3和5年的OS進(jìn)行預(yù)測,并利用校準(zhǔn)曲線對模型的預(yù)測效能進(jìn)行評估,結(jié)果顯示,LINC02321表達(dá)水平對預(yù)測UCEC患者生存的貢獻(xiàn)率達(dá)40%,校準(zhǔn)曲線顯示該Nomogram模型具有良好的預(yù)測效能。見圖2。

注：A為構(gòu)建的Nomogram預(yù)測模型;B為預(yù)測模型的校準(zhǔn)曲線。

2.4LINC02321對UCEC的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,LINC02321表達(dá)水平對于評估UCEC(AUC=0.877)、臨床分期Ⅰ(AUC=0.862)、組織學(xué)分級G1期(AUC=0.772)和腫瘤浸潤(AUC=0.915)均具有一定的診斷價(jià)值。此外,LINC02321表達(dá)水平對于評估1、3、5年OS(AUC分別為0.659、0.629和0.623)、DSS(AUC分別為0.690、0.645和0.608)和PFI(AUC分別為0.633、0.602和0.612)同樣具有診斷價(jià)值。

2.5LINC02321表達(dá)水平與UCEC免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系 LINC02321表達(dá)水平與4種免疫細(xì)胞在UCEC腫瘤微環(huán)境中的浸潤明顯相關(guān),其中與輔助性T淋巴細(xì)胞2(Th2)的浸潤呈正相關(guān)(r=0.231,P<0.001),而與CD56bright NK細(xì)胞(r=—0.342,P<0.001)、未成熟樹突狀細(xì)胞(r=—0.239,P<0.001)、嗜酸粒細(xì)胞(r=—0.204,P<0.001)的浸潤均呈負(fù)相關(guān)。

2.6LINC02321在UCEC組織中的表達(dá)驗(yàn)證 為進(jìn)一步明確LINC02321在UCEC組織中的表達(dá)趨勢,通過qRT-PCR分析20例UCEC患者腫瘤組織及癌旁組織中LINC02321的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),LINC02321在UCEC組織[3.230(1.910,5.492)]中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織[6.220(2.702,9.023)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。

3 討 論

LncRNA作為重要的調(diào)控分子類型之一,因其數(shù)量龐大且在不同生理和病理狀態(tài)下具有明顯的組織特異性與時(shí)空特異性,已成為腫瘤診斷和預(yù)后評估新型生物標(biāo)志物研發(fā)的熱點(diǎn)分子類型[17-18]。最近有研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)由6條與細(xì)胞焦亡相關(guān)的lncRNAs組成的分子標(biāo)簽與UCEC患者預(yù)后、免疫細(xì)胞浸潤、T淋巴細(xì)胞耗竭及免疫治療和化療反應(yīng)密切相關(guān),對UCEC具有良好的預(yù)測能力且有望成為提高免疫治療效果的治療靶點(diǎn)[19]。

LINC02321作為一條促癌lncRNA被發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中上調(diào)表達(dá)并參與腫瘤進(jìn)展,且作為血管生成和基底膜相關(guān)lncRNA與其他若干lncRNA組成的分子標(biāo)簽可有效預(yù)測膀胱癌患者的預(yù)后和腫瘤轉(zhuǎn)移[16,20],提示LINC02321在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。目前,LINC02321在UCEC中的表達(dá)狀況及是否參與UCEC進(jìn)展還不清楚。故本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫中UCEC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料,通過生物信息學(xué)分析對LINC02321在UCEC中的表達(dá)情況及臨床意義進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)LINC02321在配對和非配對UCEC組織中的表達(dá)水平均明顯高于正常組織,提示LINC02321具有作為UCEC診斷分子標(biāo)志物的潛力。其次,本研究發(fā)現(xiàn),LINC02321的高表達(dá)對預(yù)測UCEC患者生存期具有較大貢獻(xiàn),且對評估UCEC、組織學(xué)G1期、臨床分期Ⅰ以及1、3、5年生存期(OS、DSS和PFI)均具有良好的預(yù)測效果,表明LINC02321的高表達(dá)與UCEC患者不良臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān),進(jìn)一步提示LINC02321在UCEC中可能發(fā)揮促癌作用,是潛在的UCEC早期診斷和預(yù)后判斷的新型分子標(biāo)志物。在膀胱癌中,同樣發(fā)現(xiàn),LINC02321在腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)與膀胱癌患者不良預(yù)后密切相關(guān),并可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。本研究發(fā)現(xiàn),LINC02321的高表達(dá)與多種具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞(包括CD56bright NK細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞)在UCEC組織中的浸潤豐度呈負(fù)相關(guān),而與具有腫瘤免疫抑制功能的Th2細(xì)胞呈正相關(guān),提示LINC02321的高表達(dá)可能與UCEC免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成密切相關(guān)。最近一項(xiàng)在膀胱癌中的研究發(fā)現(xiàn),由高表達(dá)的LINC02321與AC004034.1、AL662797.1、NR2F1-AS1、SETBP1-DT、AC011503.2、AC093010.2、 LINC00649一并組成的lncRNA分子標(biāo)簽,與B淋巴細(xì)胞、濾泡Th(TFH)、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞及活化型樹突狀細(xì)胞(aDC)的浸潤均呈負(fù)相關(guān),而與NK細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)[20],提示在不同腫瘤中LINC02321可能通過影響不同類型免疫細(xì)胞的浸潤進(jìn)而參與特定免疫微環(huán)境的形成。最后,本研究通過qRT-PCR驗(yàn)證了LINC02321在UCEC組織中的上調(diào)表達(dá),后續(xù)可進(jìn)一步對UCEC患者血清和血漿樣本中LINC02321的表達(dá)及其臨床相關(guān)性和臨床意義進(jìn)行研究,為臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

綜上所述,本研究基于公共數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析揭示了lncRNA LINC02321在UCEC中異常高表達(dá)且可作為潛在的UCEC診斷、預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物以及免疫治療靶點(diǎn),同時(shí)為進(jìn)一步開展LINC02321的基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。