血清circRNA、Notch-3聯合胃蛋白酶對胃癌的診斷價值及與分期的相關性

郭 超,杜 園,張慧芳,王 輝,馬 迪,王 嵐,楊金寶

河北省涿州市醫院:1.普外科;2.內鏡中心;3.婦科;4.營養科;5.產科,河北保定 072570

胃癌現已成為全球范圍內因癌癥死亡的第3大癌,對人類生命及身體健康產生極大威脅,我國胃癌發病率及病死率占全球的45%[1-2]。早期胃癌發病較為隱匿,且進展較緩,不易被發現,容易出現漏診、誤診現象,當患者出現胃癌相關體征時,通常已發展為中晚期,治療效果及預后較差,不利于患者后續恢復,因此早發現、早治療是延長患者生存周期的關鍵[3-4]。現階段國內鑒別胃癌常用胃鏡檢查及病理診斷,這些方法具有較強的可行性,但也存在較大的局限性,胃鏡檢查較復雜,患者需承擔一定的痛苦及風險,且胃鏡檢查對設備的依賴度較高,患者的配合度較差,對于大規模的胃癌篩查及早期診斷并不適用[5-6]。部分發達國家開始嘗試采用腫瘤血清學指標進行胃癌篩查,該方法具有無創、操作簡單等優勢,現如今胃癌相關的DNA、RNA及蛋白質等腫瘤標志物對胃癌篩查具有重要意義[7-8]。胃癌患者中血清環狀RNA(circRNA)是一類共價閉合環狀RNA,具有較強的組織表達特異性,可作為腫瘤檢測及診斷的分子標志物;神經源位點缺口同源蛋白3(Notch-3)是一種高度保守的跨膜蛋白質,它與腫瘤誘導細胞的合成及調控具有一定聯系,從而進一步影響腫瘤細胞的生長;胃蛋白酶可以反映胃黏膜萎縮程度,在胃癌發生及發展過程中具有重要意義[9]。但我國關于circRNA、Notch-3及胃蛋白酶對胃癌診斷價值的研究較少,基于此,本研究對circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表達水平進行觀察,分析三者單獨及聯合檢測在胃癌診斷中的價值及其與胃癌分期的相關性。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年3月至2023年3月本院收治的150例胃癌患者和150例胃部良性病變患者分為研究組和良性組。研究組男62例,女88例;年齡42～65歲,平均(53.16±5.44)歲;體質量指數(BMI)21.16～25.58 kg/m2,平均(22.52±1.08) kg/m2;農村57例,城市93例;文化程度:大專及以上89例,高中及以下61例。良性組男63例,女87例;年齡41～66歲,平均(53.76±5.17)歲;BMI 21.22～25.69 kg/m2,平均(22.41±1.02)kg/m2;農村59例,城市91例;文化程度:大專及以上90例,高中及以下60例。兩組年齡、性別、BMI等基線資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對象均知情同意。本研究已獲得本院醫學倫理委員會審批通過(HK20201125)并且符合《赫爾辛基宣言》的操作規范與標準。研究組依據美國癌癥聯合委員會(AJCC)第7版胃癌分期指南[10]分為Ⅰ期組(36例)、Ⅱ期組(37例)、Ⅲ期組(35例)及Ⅳ期組(42例)4個亞組。納入標準:(1)經組織病理學檢測確診為胃癌;(2)外周血提取前未進行手術、放化療及免疫治療;(3)精神狀態正常;(4)臨床病歷資料完整;(5)心、肺、肝、腎等重要器官功能正常。排除標準:(1)伴有其他惡性腫瘤;(2)伴有其他嚴重內科疾病;(3)伴有其他消化系統疾病;(4)具有影響本研究藥物服用史;(5)中途退出研究。

1.2方法 采集所有研究對象5 mL外周空腹靜脈血,離心10 min(速度為3 000 r/min,半徑為10 cm),得到上層血清,置于-70 ℃環境下保存待檢。胃癌組織采集:切取所有患者經病理證實的病變組織、肉眼觀察距離病變組織5 cm的癌旁組織及正常組織,將收集到的組織標本分為兩部分,一部分采用10%甲醛溶液固定保存,另一部分立即投入液氮冷凍,置于-80 ℃環境下保存。良性病變組織采集:通過傳統手術進行胃部分切除,取部分胃部的病灶活組織作為病理活檢標本,保存待檢,檢測方法同胃癌組織。circRNA檢測:依據Trizol試劑說明書提取血清總RNA,RNA純度依據紫外分光光度計進行檢測,選取吸光度用于后續試驗,將RNA反轉錄為互補DNA(cDNA),反轉錄試劑盒購自北京啟衡星生物科技有限公司,貨號為K1622,Trizol試劑盒購自美國ABI公司,同時采用實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)方法對所有研究對象的circRNA表達水平進行檢測,PCR擴增條件為95 ℃、15 s,62 ℃、30 s,72 ℃、45 s,45個循環,采用2-ΔΔct方法對circRNA水平進行相對定量。Notch-3檢測:固定標本選用10%中性甲醛,對其進行常規脫水、透明及免疫組化染色等操作,試劑盒購自北京博奧森生物試劑公司,貨號為HB-T2177。采用qRT-PCR進行RNA提取及反轉錄為cDNA,上游引物序列為5′-CTACGACTGTGTCTGCCAACCTG-3′,下游引物序列為5′-GCTGGAAGCACACTCATTGATCTC-3′。胃蛋白酶檢測:采用酶聯免疫吸附試驗(芬蘭Biohit公司試劑盒,貨號為M20220)對胃蛋白酶水平進行測定。所有操作均由本院經驗豐富的2名專業醫師嚴格按照說明書進行。

2 結 果

2.1研究組和良性組circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表達水平對比 研究組circRNA、Notch-3及胃蛋白酶表達水平較良性組高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1～2。

注：A為胃部良性病變組織中circRNA的表達;B為胃部良性病變組織中Notch-3的表達;C為胃部良性病變組織中胃蛋白酶的表達。

注：A為胃癌組織中circRNA的表達;B為胃癌組織中Notch-3的表達;C為胃癌組織中胃蛋白酶的表達。

表1 研究組和良性組患者circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表達水平對比

2.24組circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表達水平對比 circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表達水平比較,Ⅰ期組<Ⅱ期組<Ⅲ期組<Ⅳ期組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表達水平對比

2.3circRNA、Notch-3、胃蛋白酶單獨及聯合檢測對胃癌的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示,circRNA、Notch-3、胃蛋白酶單獨檢測胃癌的曲線下面積(AUC)分別為0.797、0.802、0.848,低于3項指標聯合檢測的0.901(Z=10.799、11.231、14.492,P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 circRNA、Notch-3、胃蛋白酶單獨及聯合檢測診斷胃癌的ROC曲線

表3 circRNA、Notch-3、胃蛋白酶單獨及聯合檢測對胃癌的診斷價值

2.4circRNA、Notch-3、胃蛋白酶與胃癌分期的相關性 circRNA、Notch-3、胃蛋白酶均與胃癌分期呈正相關(r=0.585、0.581、0.645,P<0.05)。

3 討 論

我國胃癌發病率呈逐年上升趨勢,但現階段并沒有一種很好的方式預防胃癌的發生,臨床研究顯示,胃癌與遺傳、分子標志物、感染及癌前病變等均有一定聯系,屬于多因素綜合作用導致的一種疾病[11-12]。現如今胃癌發病機制并未統一,分析可能與幽門螺桿菌感染及長期胃部慢性良性疾病等有關,其早期臨床表現不明確,容易與其他胃部良性疾病混淆,可能會出現漏診、誤診現象,若不及時進行干預,則會發展為更加嚴重的胃癌,提高患者病死率,因此盡早尋找診斷胃癌的靈敏標志物是胃癌患者有效診治的關鍵[13-14]。

胃癌是由多因素導致的癌細胞大量增殖及凋亡受到抑制的結果;circRNA屬于共價閉合環狀的新型非編碼RNA分子,隨著醫療水平不斷進步,circRNA被發現廣泛存在于人體,且在不同病變組織中具有特異性表達[15]。Notch屬于一種高度保守由基因編碼的異二聚體組成的跨膜蛋白質,對細胞分化具有重要意義,由跨膜區、表皮生長因子、富含半胱氨酸樣重復序列的胞外區組成。人體中共包含Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4 4個同源體,其中Notch-3可以促進腫瘤干細胞分化[16-17]。胃蛋白酶可以間接反映同部位胃黏膜腺體的組織狀態及胃黏膜特異性功能酶水平,在胃癌早期診斷及預后中具有重要應用價值[18-19]。本研究結果顯示,研究組circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表達水平較良性組更高,Ⅳ期組circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表達水平較Ⅰ期組、Ⅱ期組及Ⅲ期組更高,差異均有統計學意義(P<0.05),此外circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表達水平與胃癌分期均呈正相關(r=0.585、0.581、0.645,P<0.05)。這提示circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表達水平在不同胃癌分期患者中均有異常表達。其原因可能是circRNA具有微小RNA(miRNA)分子海綿作用,參與RNA結合蛋白及多種病理過程,circRNA表達水平越高,胃癌越嚴重,且circRNA可以影響信使RNA(mRNA)的穩定性并調節其在細胞內的表達,主要是通過與mRNA的3′非翻譯區結合完成。胃癌細胞侵襲轉移階段circRNA表達水平上升會促進胃癌遷移[20]。Notch-3信號轉導通路中Notch-3受體的基因表達水平與胃癌的發生及發展具有緊密聯系,Notch-3可以在胃癌組織中保持高增殖低分化狀態,并且其增殖能力也隨胃癌的不斷發展而不斷提升,胃癌的發生、發展會加速體外轉化細胞中Notch-3的分泌,并且可以發揮體內異種移植模型的藥理作用,進一步加快腫瘤發展[21-24]。胃蛋白酶表達水平在胃黏膜出現損傷時會發生相應變化,同時可以體現出胃體黏膜泌酸作用,胃黏膜出現損傷后,其表達水平會顯著上升,造成腫瘤細胞分化程度較差,成熟細胞功能保留較少,淋巴結轉移較多,腫瘤侵襲能力較強,影響患者預后。circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表達水平隨胃癌加重其表達水平不斷升高,與胃癌分期呈正相關。

本研究顯示,circRNA、Notch-3、胃蛋白酶單獨及聯合檢測對胃癌具有一定的診斷價值,其中3項指標聯合檢測的診斷的AUC更高,為0.901,這提示circRNA、Notch-3、胃蛋白酶均可作為早期篩選胃癌的生物標志物,3項指標聯合檢測的診斷效能更優。

綜上所述,circRNA、Notch-3、胃蛋白酶在胃癌及胃癌不同分期中均有異常表達,且circRNA、Notch-3、胃蛋白酶單獨及聯合檢測對胃癌具有一定診斷價值,3項指標聯合檢測的AUC更高,可作為臨床診斷胃癌的特異性指標。但本研究樣本量較少,可能使結果存在一定偏倚,后續還需進行樣本量更大的研究為臨床診斷胃癌提供參考。