ABO正反定型不符的白血病患者血型鑒定與臨床分析

李 茜,張智慧,高力立,彭沫溱,陳 璐,趙梓昕,寸 偉,羅 臻,蘇品璨

云南昆明血液中心輸血研究室,云南昆明 650106

輸血作為一種臨床救治患者的常用治療手段,既可提高患者攜氧功能,又能改善其凝血功能障礙,因此,輸血前的ABO血型鑒定對保障臨床輸血安全尤為重要。ABO血型是由ABO基因編碼決定的,一般情況下人體ABO血型不會發(fā)生改變。白血病是起源于造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病[1-2],白血病患者處于疾病狀態(tài)可能引起自身體內(nèi)血細(xì)胞或血漿成分發(fā)生改變,導(dǎo)致ABO抗原減弱或ABO抗體效價降低,出現(xiàn)ABO血型鑒定正反定型不相符的情況,極易引起血型誤判,直接關(guān)系臨床輸血安全[3-4]。多種因素均可導(dǎo)致患者ABO抗原減弱,近年來,有研究發(fā)現(xiàn),ABO基因啟動子區(qū)甲基化程度與ABO抗原表達(dá)異常有關(guān)[5-8],但相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少見。本研究通過血清學(xué)、聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)檢測和ABO基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測等檢測手段對1例白血病患者的ABO血型鑒定檢測異常結(jié)果、原因及處理方法進(jìn)行了分析,初步探討了白血病中ABO基因甲基化狀態(tài)異常導(dǎo)致ABO抗原表達(dá)減弱在輸血相容性檢測中的臨床意義,以期為臨床診療提供參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 血液標(biāo)本來源于云南省腫瘤醫(yī)院,患者,女,24歲,患惡性血液病,有2次輸血史,患者知情同意本研究并簽署知情同意書。患者于2022年2月3日初次診斷為白血病,目前患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)為206×109/L,血紅蛋白(Hb)為51 g/L,血小板計(jì)數(shù)(PLT)為38×109/L,同時伴有脾臟腫大。患者嚴(yán)重貧血,急需輸血,因其ABO血型鑒定正/反定型不一致(正定型結(jié)果為O型,反定型結(jié)果為A 型),醫(yī)院將患者血液標(biāo)本送檢至血液中心進(jìn)行ABO血型鑒定和疑難交叉配血實(shí)驗(yàn)。

1.2儀器 ABO血型定型檢測卡配套孵育器和離心機(jī)(長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司),KA2200 型血型血清學(xué)專用離心機(jī)(日本久保田公司),電熱恒溫水浴箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司),冰箱(海爾集團(tuán)海爾電冰箱有限公司),MagCore HF16 自動核酸提取儀(中國臺灣RBC Bioscience公司),T100 PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad Laboratories公司),PowerPac TM 基礎(chǔ)電泳儀(美國Bio-Rad Laboratories公司),ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad Laboratories公司),3730測序列分析儀( 美國ABI公司),SW-CJ-1D潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠),DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司),YXJ-2離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司),H6-1微型電泳槽(上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠),U-3010紫外-可見分光光度計(jì)(Hitachi公司),移液器(范圍100～1 000 μL,20～200 μL,0.5～10 μL,德國艾本德EPPENDORF公司)。

1.3試劑 抗-A、抗-B血型定型試劑-單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號20220101),ABO血型卡正/反定型和RhD血型檢測卡-微柱凝膠法(DiaMed GmbH/Bio-Rad低離子抗人球蛋白卡,批號50093.11.28),抗-A1凝集素(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號20221019),抗-H單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號20221110),抗-AB抗體(DIAGAST,批號464000),抗人球蛋白[抗免疫球蛋白G(抗-IgG),抗-C3d]檢測試劑盒(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號20225001),抗-IgG檢測試劑盒(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號20215102),抗C3d檢測試劑盒(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號20225201),人ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑盒(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號20235313),低離子抗人球蛋白卡-微柱凝膠法(DiaMed GmbH/Bio-Rad,批號50531.76.10),不規(guī)則抗體檢測試劑(人血紅細(xì)胞,長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號20221208),紅細(xì)胞血型抗體篩選細(xì)胞(微柱凝膠法)Serascan Diana 3(Diagnostic Grifols,S.A.西班牙基立福公司,批號23007.01);核酸提取試劑盒(中國臺灣RBC Bioscience 公司,批號 P4101- 17230);人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒PCR-SSP法 (天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司,批號202004001),MethylEdgeTMBisulfite Conversion System(Promega,批號0000470334),焦碳酸二乙酯處理水(碧云天 Beyotime,批號111122230306),TaKaRa EpiTaqTMHS (TaKaRa,批號AM20984A),加樣緩沖液(Takara,批號ALG988A),BigDye測序反應(yīng)試劑盒(ABI 公司,批號91235489),POP 7測序膠(ABI 公司,批號2211711),10×電泳緩沖液(ABI 公司,批號2208378)。

1.4檢測方法

1.4.1血型血清學(xué)檢測 采集患者肘部靜脈血進(jìn)行檢測,ABO血型正/反定型鑒定、間接抗人球蛋白試驗(yàn)、不規(guī)則抗體篩查采用微柱凝膠卡法和試管法;直接抗人球蛋白試驗(yàn)(DAT)采用試管法;將抗-A、抗-B分別與經(jīng)鹽水洗滌3次的受檢者濃縮紅細(xì)胞等量混合進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)。所有試驗(yàn)操作均按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[9-10]和試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2PCR-SSP檢測 取患者乙二胺四乙酸外周抗凝全血400 μL,使用自動核酸提取儀提取基因組DNA,采用微量紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 濃度和純度。按照人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒說明書進(jìn)行PCR-SSP 法基因分型PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。配制2.0%的瓊脂糖凝膠,將5 μL擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,于120 V恒定電壓條件下電泳40 min后使用凝膠成像系統(tǒng)成像,記錄試驗(yàn)結(jié)果并根據(jù)試劑盒說明書結(jié)果分型表判定基因型。

1.4.3ABO基因啟動子區(qū)甲基化檢測 采用亞硫酸氫鹽測序法(BSP)檢測標(biāo)本ABO基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。根據(jù)MethylEdgeTMBisulfite Conversion System試劑盒說明書,對患者基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾,使檢測標(biāo)本基因組DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶通過亞硫酸氫鹽處理后轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,甲基化的CpG胞嘧啶則不變。在NCBI數(shù)據(jù)庫下載ABO基因序列,應(yīng)用Methyl primer express software v1.0和MethPrimer軟件選取ABO基因啟動子區(qū)富含CpG位點(diǎn)的區(qū)域,并設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,檢測片段分別為175、160 bp,共包含13個CpG位點(diǎn),分別編號為1～13,擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,上游引物序列1:ATGTTGTTTAGGTTGGAGTGTAGTG,下游引物序列1:ACCAACATAATAAATCCTCCATCTC;上游引物序列2:TTTTAAGTAGTTGGGGTTATAGAT,下游引物序列2:ACCTACAATCCTAACACTTTC AA。以亞硫酸氫鹽修飾后的患者基因組DNA為模板,根據(jù)TaKaRa EpiTaqTMHS說明書要求擴(kuò)增目標(biāo)序列。PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括亞硫酸氫鹽修飾后DNA模板2 μL,TAKARA EpiTaqTMHS(5 U/μL) 0.25 μL,10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5 μL,25 mM MgCl25 μL,2.5 mM dNTP Mixture 6 μL,上下游引物各2 μL,其余用無菌水補(bǔ)足。PCR條件為94 ℃,1 min;98 ℃,10 s;57 ℃,30 s;72 ℃,30 s;40個循環(huán);72 ℃ 終延伸10 min;終止在4 ℃。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳后對目的條帶進(jìn)行切膠,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收;使用HieffCloneTMZero TOPO-TA Cloning Kit試劑盒對目的片段進(jìn)行目的片段TA克隆;使用生工質(zhì)粒提取試劑盒SK8191 UNIQ-10 柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA;將質(zhì)粒使用PstⅠ單酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小,確定是否含有目的片段,鑒定陽性克隆子;將陽性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Chromas(Version 2.3)軟件分析測序峰圖,使用甲基化分析軟件BIQ Analyzer分析目標(biāo)序列CpG位點(diǎn)甲基化情況,并將BSP測序結(jié)果以圓圈圖輸出。目標(biāo)序列中有13個CpG島位點(diǎn),計(jì)算CpG島甲基化位點(diǎn)數(shù)占總CpG島位點(diǎn)的百分比,計(jì)算甲基化率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ABO血型鑒定 患者ABO 血型正定型結(jié)果為O型,反定型結(jié)果為A型,正反定型結(jié)果不一致,4 ℃時試管法可見A1c凝集。見表1。不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)結(jié)果顯示,患者血漿與3種抗體篩查細(xì)胞均無凝集。見表2。DAT結(jié)果顯示,抗-IgG+C3d、抗-IgG、抗-C3d均為陰性。吸收放散試驗(yàn)結(jié)果顯示,患者紅細(xì)胞表面存在A抗原。見表3。

表1 ABO血型鑒定正反定型結(jié)果

表2 不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)結(jié)果

表3 受檢者吸收放散試驗(yàn)結(jié)果

2.2PCR-SSP法檢測 ABO基因分型檢測出患者PCR-SSP基因分型格局1、2、4、6、8、9、11孔為陽性,3、5、7、10孔為陰性。對照人類紅細(xì)胞 ABO 血型基因分型試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)結(jié)果分型表判定患者基因型為AO1,表型為A型。見圖1。

注：片段大小從下至上依次為100、250、500、750、1 000 bp和2 000 bp;檢測目的條帶均同時檢測內(nèi)參質(zhì)控帶,內(nèi)參為人類生長激素基因的保守片段,大小約為1 000 bp。

2.3ABO基因啟動子區(qū)甲基化檢測 經(jīng)BSP檢測ABO基因啟動子區(qū)部分序列的甲基化水平,待檢測標(biāo)本DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽試劑盒轉(zhuǎn)化處理后甲基化的胞嘧啶不發(fā)生改變,經(jīng)PCR擴(kuò)增和TA克隆測序檢測到該CG位點(diǎn)仍為CG;而未甲基化修飾的胞嘧啶則轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,經(jīng)PCR擴(kuò)增和TA克隆測序檢測到該CG位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為TG。檢測標(biāo)本的甲基化率指檢測區(qū)域中甲基化的CpG數(shù)量與該區(qū)域CpG總數(shù)量的比值。將ABO基因啟動子富含CpG島區(qū)域檢測片段大小為175、160 bp序列進(jìn)行TA克隆測序。見圖2～4。甲基化狀態(tài)分析結(jié)果顯示,患者標(biāo)本ABO基因啟動子區(qū)甲基化率為66.7%,高于隨機(jī)選取的5例正常對照組標(biāo)本平均甲基化率(<25%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：箭頭表示該CG位點(diǎn)的C為甲基化的堿基。

注：箭頭表示CG位點(diǎn)的C未被甲基化,CG轉(zhuǎn)化為TG。

注：DZ1、DZ2、DZ3、DZ4、DZ5為對照組標(biāo)本,SC為受檢白血病患者標(biāo)本;○為非甲基化位點(diǎn),●為甲基化位點(diǎn);圖中分別為患者標(biāo)本和正常對照組標(biāo)本ABO基因啟動子175 bp和160 bp區(qū)域甲基化狀態(tài)分析情況。

注：與正常對照組比較,aP<0.001。

3 討 論

白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病,由于發(fā)生病變的白細(xì)胞失去分化成熟的能力,停滯于其發(fā)育的不同階段,進(jìn)而引起患者骨髓和其他造血組織中病變細(xì)胞大量增殖積聚并浸潤其他器官和組織,導(dǎo)致患者造血功能異常,出現(xiàn)病態(tài)造血而無法產(chǎn)生足量的正常血細(xì)胞,臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀,輸血是白血病非常重要的輔助治療手段之一[1-2]。在臨床輸血治療過程中ABO血型的正確鑒定尤為重要。人類ABO血型抗原由ABO基因編碼,ABO基因位于人類第 9號染色體的長臂,屬于常染色體顯性遺傳,一般情況下不會發(fā)生變化[11]。有研究表明,急性髓系白血病患者處于其病情發(fā)作期可能出現(xiàn)紅細(xì)胞血型抗原減弱、消失或變異,其原本的ABO血型抗原無法正常檢出,導(dǎo)致ABO正/反定型不一致,極易引起血型誤判,影響輸血安全[12]。近年來,分子生物學(xué)基因分型技術(shù)、血型基因甲基化檢測技術(shù)在ABO疑難血型鑒定中的廣泛應(yīng)用,其將新技術(shù)與傳統(tǒng)血型血清學(xué)鑒定技術(shù)相結(jié)合,可快速、準(zhǔn)確地鑒定疑難ABO血型,并且進(jìn)一步合理解釋疾病狀態(tài)下抗原減弱的原因,為更加安全、合理地解決臨床疑難血型鑒定問題提供了新思路。

本例患者使用微柱凝膠法進(jìn)行ABO血型鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示,正定型結(jié)果為O型,反定型結(jié)果為A型,正反定型結(jié)果不一致。排除微柱凝膠卡、反定型試劑、離心設(shè)備運(yùn)行及其他人為因素的干擾后采用試管法分別于室溫、4 ℃和37 ℃條件下重復(fù)ABO正反定型試驗(yàn),結(jié)果顯示,3個溫度下正定型均為O型,而反定型在4 ℃時試管法可見A1c凝集,推測患者產(chǎn)生不規(guī)則抗-A1抗體。微柱凝膠法進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查和試管法進(jìn)行直接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果均為陰性,排除是自身抗體造成的ABO正反定型不符[13]。結(jié)合患者處于白血病發(fā)作期,其ABO血型鑒定正反定型不符可能是紅細(xì)胞本身所致,經(jīng)吸收放散試驗(yàn)后檢出患者紅細(xì)胞表面存在弱 A 抗原。基于血液免疫學(xué)檢測試驗(yàn),由白血病疾病狀態(tài)下導(dǎo)致受試者A抗原減弱與ABO亞型引起的紅細(xì)胞抗原數(shù)量減少的試驗(yàn)檢測結(jié)果較為相似,難以鑒別,需進(jìn)一步結(jié)合其他檢測技術(shù)加以鑒別。本研究使用分子生物學(xué)血型基因分型PCR-SSP法進(jìn)行檢測,本例患者ABO基因分型結(jié)果為AO1,表型為A型,即可排除ABO亞型的可能,而其正定型結(jié)果為弱A表型,有研究在髓系惡性腫瘤[4]、骨髓增生異常綜合征[14-15]、急性髓系白血病[15-16]、慢性粒細(xì)胞白血病[17]、膀胱癌[18]和口腔癌[8,19]等患者中均檢測到ABO抗原減弱的現(xiàn)象,與本研究結(jié)果一致。

目前,對于血型抗原減弱的確切原因尚未明確,且患者出現(xiàn)ABO抗原減弱的現(xiàn)象不是持續(xù)的,在疾病緩解后還有可能恢復(fù)血型抗原表達(dá)[20]。推測為機(jī)體在白血病狀態(tài)下的ABO基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制發(fā)生了改變,而這種調(diào)控機(jī)制目前尚未明確。近年來,甲基化已成為腫瘤研究的熱點(diǎn),甲基化是一種表觀遺傳修飾方式,參與機(jī)體疾病狀態(tài)下的基因表達(dá)調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn),白血病患者ABO抗原減弱與DNA甲基化導(dǎo)致ABO基因沉默的關(guān)系更為密切[18]。基于此,推測患者ABO基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的異常可能與其A抗原表達(dá)減弱有關(guān)。本研究對患者標(biāo)本ABO基因啟動子區(qū)175、160 bp 2個區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,檢測區(qū)域患者標(biāo)本ABO基因啟動子區(qū)甲基化率為66.7%,明顯高于隨機(jī)選取的5例正常對照組標(biāo)本平均甲基化率(<25%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有研究表明,ABO基因啟動子CpG島甲基化程度與ABO抗原表達(dá)呈負(fù)相關(guān),甲基化程度越高ABO基因表達(dá)越不活躍,從而導(dǎo)致A、B抗原表達(dá)均減少[5,8,18];且白血病患者存在不同程度A、B抗原減弱[21],與本研究結(jié)果一致。提示患者白血病狀態(tài)下ABO基因啟動子區(qū)甲基化程度增高可能與ABO抗原減弱之間存在較為密切的相關(guān)性,因機(jī)體抗原減弱的調(diào)控機(jī)制是多因素共同作用的結(jié)果,而ABO啟動子甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)下調(diào)僅可能只是ABO抗原減弱的其中一個因素,其機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

本研究結(jié)果提示,本例白血病患者在疾病發(fā)作期,其ABO基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)異常可作為導(dǎo)致ABO抗原減弱的重要因素之一,從而干擾ABO正反定型鑒定。在臨床輸血實(shí)踐中開展血清學(xué)疑難血型鑒定的同時進(jìn)行分子生物學(xué)基因分型和血型基因甲基化檢測可作為血清學(xué)方法的有效輔助手段,有效縮短了輸血相容性試驗(yàn)檢測時間,保障臨床用血安全、合理、有效,為實(shí)現(xiàn)患者個體化血液管理、做到精準(zhǔn)輸血提供了新思路。