D-二聚體和纖維蛋白(原)降解產物質控品復溶后穩定性研究

李亞軍,孫 滔,余 抒

重慶郵電大學附屬重鋼總醫院檢驗科,重慶 400081

質控品是用于實驗室質量監測、評估并確保結果可靠的重要元素,質控品復溶后的穩定性是確保質量一致性的關鍵,正確的凍存方式、合適的凍存溫度、凍存速率是保證質控品性能穩定的關鍵因素。為確保質控品的質量和可靠性,其存儲和復溶方式的選擇應根據每種質控品的理化性質和穩定性來決定。血漿D-二聚體(D-D)和纖維蛋白(原)降解產物(FDP)是交聯纖維蛋白或纖維蛋白(原)經纖溶酶作用后的降解產物,D-D是其中最小的片段,相對分子質量約為62 ku,在人體內半衰期約為3 h,D-D與FDP是反映機體凝血及纖溶狀態的重要標志物[1]。

近年來,D-D和FDP的應用價值不斷被發掘,且隨著檢測技術精確性的不斷提高,D-D和FDP在對血栓、腫瘤、膿毒癥等相關疾病的診斷和治療評估中具有至關重要的作用[2-8]。但目前D-D和FDP既無國際標準、國內外也無統一標準品,且檢測位點不統一,各檢測系統的方法一致性較差,導致二者的質量控制存在難度和瓶頸。為保證質控品質量穩定,多數實驗室采用進口的D-D和FDP凍干質控品,但凍干質控品價格昂貴、開瓶復溶后的效期短、不能反復凍融,可使用頻次受限,不僅浪費質控品,而且加大了實驗室質控成本。因此,尋找質控品復溶后在一定時間均能穩定保存及使用的方法是解決質控品質量控制的技術難題。李曼輝等[9]自制的凝血3項質控品在—20 ℃保存可穩定22 d。況妮娜[10]指出,進口凝血質控品復溶后冷凍保存在—20 ℃可穩定5 d。黃新強等[11]報道商品化纖維蛋白(原)質控品復溶后在4 ℃冷藏保存時穩定性更好。吳曉華等[12]自制的D-D質控品在—20 ℃保存穩定性良好。為進一步明確D-D和FDP質控品復溶后的保存條件,本研究將D-D和FDP質控品復溶后分別保存在4 ℃和—20 ℃環境中,并對其穩定性、精密度進行了分析,以期尋找簡單、實用的保存方法,為臨床保存D-D與FDP提供參考依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 儀器選用日本積水醫療生產的CP3000全自動凝血分析儀,試劑選用原裝D-D、FDP檢測試劑和配套耗材。質控品選擇檢測系統生產商配套的日本積水醫療生產的D-D與FDP質控品[13](批號:908RAT),含低值和高值兩個水平。

1.2方法

1.2.1實驗方法 采用膠乳免疫比濁法檢測D-D和FDP水平,由固定人員采用相同操作進行實驗。根據質控品說明書,開瓶配制質控品后在2～10 ℃環境可保持2周穩定,—80 ℃凍存可保持1個月穩定,復溶后凍融僅限1次。結合本實驗室條件將質控品分為冷藏組和冷凍組,取兩個不同水平(批號:908RAT,D-D與FDP靶值濃度低值分別為2.7 μg/mL、10.0 μg/mL,高值分別為8.4 μg/mL、30.2 μg/mL)的FDP質控品各10瓶作為研究對象,每瓶分別加入1 mL蒸餾水復溶10 min。將10瓶低值混合成一瓶并充分混勻后分裝入30支EP管中,每支分裝300 μL;再將10瓶高值同樣處理分裝為30支EP管中,每支分裝300 μL。從分裝好的EP管中低值和高值各取15支作為冷藏組(30支,4 ℃保存),低值和高值分別剩余的15支作為冷凍組(30支,-20 ℃保存)。從冷藏組低值和高值各取1支當日檢測D-D和FDP水平各5次,剩余的放入4 ℃冷藏保存;從冷凍組低值和高值各取1支當日檢測D-D和FDP水平各5次,剩余的放入—20 ℃冷凍保存。次日起,每日分別取冷藏組和冷凍組各水平EP管1支,室內自然復溫平衡30 min后使用相同儀器及試劑檢測D-D和FDP各5次,連續進行15 d,共檢測150次。以復溶當天的檢測結果作為第1天,后續每天按順序記為第2、 3天,直至第15天,觀察質控品復溶后兩種保存方法的穩定性及精密度。

1.2.2記錄質控品復溶分裝后管間均一性 將上述復溶分裝好的質控品在分組前,分別隨機抽取高值和低值的30支EP管中的6支樣本,每支分別檢測D-D和FDP水平,各5次,對獲得的數據進行分析,評價同水平各管間均一性。

2 結 果

2.1兩組不同保存時間穩定性比較 冷藏組D-D和FDP低值第4～15天、D-D高值第6～15天、FDP高值第10～15天的檢測值均明顯低于第1天,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。冷凍組D-D低值第10～15天、D-D高值第11～15天、FDP低值和高值第14～15天的檢測值均明顯低于第1天,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與第1天比較,aP<0.05。

注：與第1天比較,aP<0.05。

表1 兩組累積精密度比較

圖3 兩組累積精密度比較

2.3復溶分裝后管間均一性比較 D-D低值、FDP低值、D-D高值、FDP高值管間均一性比較,差異均無統計學意義(F=0.134、0.399、0.157、0.188,P=0.983、0.845、0.976、0.964)。

3 討 論

質量是檢驗工作的核心,質量控制是保證質量的有效手段,優質的質控品是實現質量控制的重要元素。凝血相關因子檢測是法規規定必須進行室內質控的項目[15],目前凝血相關因子的質控品大多數為凍干粉制劑,其優點是瓶間差異小、性能穩定、保存時間長,但價格較貴。本實驗室配備的CP3000凝血分析儀,因其精密度優、準確度高、檢測線性范圍寬、檢測限低、攜帶污染低等特點[16],目前在全國實驗室使用廣泛。該儀器采用膠乳免疫比濁法檢測D-D和FDP,配套質控品為凍干粉血漿,需復溶后使用,但不可反復凍融,若每天新溶一支質控品使用不僅浪費,而且會使質控成本飆升,不利于中小實驗室質控工作開展。因此,對凍干質控品復溶后采取恰當的保存方式延長其穩定性、有效提高質控品使用效率、保證質控效能、顯著降低實驗室質控成本十分必要。

本研究將質控品復溶分裝后分別按冷藏和冷凍的方式保存,結果顯示,冷藏保存D-D和FDP的低值均在4 d就開始明顯降低,高值分別在6、10 d開始降低,冷凍保存時兩個水平的D-D均超過10 d,FDP均超過14 d時才開始明顯降低,表明質控品復溶后低溫保存可以延長其穩定時間,溫度越低穩定時間越長,與武建偉等[17]研究的D-D在低溫環境保存時間更長一致。D-D和FDP低值在冷藏時僅穩定保存3 d,冷凍時則可穩定保存9 d,D-D和FDP高值在冷藏時可穩定保存5 d,而冷凍時能穩定保存10 d。冷凍保存的穩定時間是冷藏的2～3倍,特別是在低值時,差距更是達到3倍,表明冷凍保存的穩定性更好。冷藏時D-D和FDP高值的穩定時間是低值的2～3倍,表明冷藏對質控品不同水平之間的影響較大,而冷凍時D-D和FDP不同水平的穩定時間基本一致,表明冷凍對質控品不同水平之間的影響較小,進一步表明冷凍保存的穩定性更好。D-D和FDP質控品復溶后會持續降解,導致結果持續降低,而低溫可延緩降解速度,溫度越低降解速度越慢,與凝血質控品保存效果相似[18]。

綜上所述,分裝冷凍法適用于D-D和FDP凍干質控品復溶后的保存,值得推廣應用。