基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接挖掘黑骨藤治療強(qiáng)直性脊柱炎的作用機(jī)制

馬熙 李浩 凌益 馬武開

【摘 要】目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究黑骨藤治療強(qiáng)直性脊柱炎的作用機(jī)制。方法：通過檢索文獻(xiàn)和TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黑骨藤的活性成分信息。疾病靶點(diǎn)基因由DISGENET數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得，通過瑞士目標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測藥物成分靶點(diǎn)，借助cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，使用STRING在線平臺下載靶點(diǎn)相互作用數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，挖掘核心靶點(diǎn)；運(yùn)用DAVID平臺對所預(yù)測核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析。最后將篩選出的主要活性成分與核心靶點(diǎn)在pymol、autotool等軟件下完成分子對接。結(jié)果：篩選出黑骨藤12個(gè)有效成分及422個(gè)藥物靶點(diǎn)，與強(qiáng)直性脊柱炎交集靶點(diǎn)71個(gè)，其主要成分有異丙基二烯酚、漢黃芩素、山奈酚等，核心靶點(diǎn)是STAT3、MAPK1、MAPK14、JAK2、JAK1等。GO功能和KEGG通路分析獲得主要通路：參與生長激素信號通路JAK-STAT級聯(lián)反應(yīng)、JAK-STAT級聯(lián)、STAT蛋白的酪氨酸磷酸化、Th17細(xì)胞分化、Th1和Th2細(xì)胞分化等。分子對接顯示，成分與靶點(diǎn)都可有效結(jié)合，漢黃芩素與JAK1結(jié)構(gòu)最優(yōu)。

結(jié)論：從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度預(yù)測了黑骨藤對強(qiáng)直性脊柱炎的治療作用，主要以漢黃芩素、山奈酚等有效成分，作用于JAK1、JAK2等靶點(diǎn)，通過JAK/STAT、MAPK等信號通路實(shí)現(xiàn)，為后續(xù)研究奠定了的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 強(qiáng)直性脊柱炎；黑骨藤；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；靶點(diǎn)

Exploring the Action Mechanism of Periploca Forrestii in Treating Ankylosing Spondylitis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

MA Xi，LI Hao，LING Yi，MA Wu-kai

【ABSTRACT】Objective：To study the action mechanism of Periploca forrestii in the treatment of ankylosing spondylitis using network pharmacology technology.Methods：The active ingredient information of Periploca forrestii was retrieved through literature search and TCMSP database.The disease target genes were obtained from the DISGENET database and GeneCards database，and drug component targets were predicted using the Swiss target prediction database.A “Chinese medicine-compound-target” network was constructed using cytoscape software，and target interaction data was downloaded using the STRING online platform.A PPI protein interaction network was constructed to explore core targets;the DAVID platform was used to perform GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis on proteins in the predicted core target network.Finally，the selected main active ingredients and core targets were subjected to molecular docking using software such as Pymol and Autotool.Results：Twelve effec-

tive ingredients and 422 drug targets were

screened from Periploca forrestii，and 71 targets intersected with ankylosing spondylitis.The main components of Periploca forrestii included isopropyldienol，baicalin，and kaempferol，while the core targets were STAT3，MAPK1，MAPK14，JAK2 and JAK1.GO function and KEGG pathway analysis revealed the main pathways involved in the growth hormone signaling pathway JAK-STAT cascade，JAK-STAT cascade，tyrosine phosphorylation of STAT protein，Th17 cell differentiation，Th1 and Th2 cell differentiation.Molecular docking showed that both components and targets could effectively bind，and the structure of baicalin and JAK1 was optimal.Conclusion：From the perspective of network pharmacology，the therapeutic effect of Periploca forrestii on ankylosing spondylitis was predicted，mainly using effective ingredients such as baicalin and kaempferol，which acted on targets such as JAK1 and JAK2 through signaling pathways such as JAK/STAT and MAPK，laying a certain foundation for subsequent research.

【Keywords】 ankylosing spondylitis;Periploca forrestii;network pharmacology;molecular docking;target points

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以侵犯脊柱、骶髂關(guān)節(jié)為特點(diǎn)的常見風(fēng)濕病，持續(xù)的炎癥會導(dǎo)致纖維化和鈣化，發(fā)展為骨性強(qiáng)直與關(guān)節(jié)畸形［1］。本病多發(fā)于青壯年男性，我國發(fā)病率為0.3%［2］，49%的AS患者最終可導(dǎo)致脊柱畸形［3］，是一種致殘率極高的疾病。AS發(fā)病主要通過免疫介導(dǎo)，涉及遺傳、感染、免疫等多種因素，病理與多種細(xì)胞因子及通路相關(guān)［4］。黑骨藤為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca Linn.）植物的根或全株，具有祛風(fēng)除濕、活血消癰功效，是貴州苗族地區(qū)治療跌打損傷、風(fēng)濕、骨折等的常用藥物。黑骨藤多種活性成分，如黃酮類、甾體類、萜類等有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、提高免疫力等作用，對AS等風(fēng)濕病有明顯療效［5］，但黑骨藤作用于AS的

機(jī)制并不清楚。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黑骨藤治療AS的作用機(jī)制，以期為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黑骨藤化學(xué)成分獲取及靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)化 從文獻(xiàn)和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）中獲得黑骨藤主要化合物，在TCMSP數(shù)據(jù)庫對所獲化合物進(jìn)行篩選。所獲得有效成分通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得簡化

分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular input line entry specification，SMILES）序列，將SMILES

序列輸入瑞士目標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。

1.2 AS靶點(diǎn)的篩選 以“ankylosing spondylitis”為關(guān)鍵詞，在DISGENET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org）和GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）搜索，找到與AS相關(guān)的靶點(diǎn)基因，篩選與疾病相關(guān)度中心值以上靶點(diǎn)進(jìn)行研究。

1.3 核心靶點(diǎn)圖的構(gòu)建 將篩選后的有效成分與疾病靶點(diǎn)關(guān)系進(jìn)行整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點(diǎn)分別代表藥物、活性成分、共同靶點(diǎn)，邊代表節(jié)點(diǎn)間的相互作用關(guān)系。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STING功能關(guān)聯(lián)蛋白網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫在線平臺（https：//string-db.org）對疾病-藥物交集基因進(jìn)行相互作用分析，得到核心靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。

1.5 GO生物功能及KEGG信號通路富集分析 通過DAVID平臺（https：//david.ncifcrf.gov）對所獲核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，以P < 0.05為篩選條件，得到GO和KEGG結(jié)果。最后借助微生信平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn）對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對接 篩選在Degree值前5位活性成分作配體，在TCMSP下載MOL2格式結(jié)構(gòu)。篩選度值前5位靶基因作受體，在PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）下載蛋白三維結(jié)構(gòu)。利用pymol（https：//pymol.org/2/）軟件將靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)去除水分子、提取配體等，并保存為pdb格式。后面的操作在Autodock（https：//autodocksuite.scripps.edu）可視化軟件Autodock Tools1.5.7完成，首先將配體MOL2格式、受體pdb格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件。運(yùn)用AutoDock-4軟件用“盲對接”，模擬退火算法進(jìn)行對接。結(jié)果保存為pdbqt格式文件。利用Openbabell（https：//openbabel.org）軟件把pdbqt格式轉(zhuǎn)換為pdb格式，最后將pdb格式文件導(dǎo)入Pymol軟件對結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。選擇結(jié)合能最小的結(jié)構(gòu)為最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 黑骨藤活性成分及相關(guān)靶點(diǎn) 通過文獻(xiàn)［5-6］和TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黑骨藤活性成分，去重后剩余40個(gè)。TCMSP數(shù)據(jù)庫設(shè)置過濾條件，篩選具有較高口服生物利用度（OB）≥30%的分子和類藥性（DL）≥0.18的分子［7］，最終篩選出12個(gè)活性成分（見表1）參與本研究。在PubChem數(shù)據(jù)庫輸入化合物名稱得到12個(gè)化合物的SMILES號。通過得到的SMILES號在瑞士目標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫對化合物進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。所有化合物靶點(diǎn)基因合并后，刪除重復(fù)得到靶點(diǎn)基因422個(gè)。

2.2 黑骨藤成分治療AS潛在靶點(diǎn) 預(yù)測疾病靶點(diǎn)在DISGENET數(shù)據(jù)庫獲得710個(gè)，取相關(guān)度值中心數(shù)以上靶點(diǎn)332個(gè)。GeneCards數(shù)據(jù)庫2274個(gè)，取相關(guān)度值中心數(shù)以上靶點(diǎn)684個(gè)。刪除重復(fù)值，最終獲得AS疾病靶點(diǎn)800個(gè)。與黑骨藤藥物成分潛在靶點(diǎn)對比匹配，共獲得71個(gè)交集靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖，見圖1。

2.3 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將活性成分及71個(gè)交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。圖中橙色為黑骨藤的活性成分，綠色為靶點(diǎn)，并對該網(wǎng)絡(luò)圖中的化合物節(jié)點(diǎn)的度值進(jìn)行分析，度值越大，說明該成分在治療AS的過程中所發(fā)揮的作用也越大。化合物度值較大的是異丙基二烯酚（isopropylidenkireno l）、

漢黃芩素（wogonin）、山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、杠柳苷元（periplogenin）等，見表2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STING平臺對黑骨藤與AS交集的71個(gè)基因進(jìn)行相互作用分析，生物種類設(shè)定為人類（Homo sapiens），置信度 > 0.9，其余參數(shù)默認(rèn)，隱藏?zé)o交集靶點(diǎn)，得到邊數(shù)為92，平均節(jié)點(diǎn)度2.59，PPI富集P < 0.01的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯ㄟ^度值篩選前15位作為核心靶點(diǎn)做進(jìn)一步分析，包括STAT3、MAPK1、MAPK14、JAK2、JAK1等，見表3，圖4。

2.5 KEGG和GO分析 將上述得到的15個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)平臺進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。獲得GO功能條目153條，其中生物過程（BP）102個(gè)、細(xì)胞組分（CC）18個(gè)、

分子功能（MF）33個(gè)；KEGG通路富集分析獲得54條通路。以P值為標(biāo)準(zhǔn)，-Log P值越大表明富集程度越大。利用微生信平臺，把GO功能富集分析每部分顯著性前10條（P < 0.05）繪制條形圖（見圖5）和顯著性前20條（P < 0.05）通路繪制KEGG通路富集分析條形圖，見圖6。

GO分析結(jié)果顯示，BP與參與生長激素信號通路JAK-STAT級聯(lián)反應(yīng)、JAK-STAT級聯(lián)、STAT蛋白的酪氨酸磷酸化、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等具有相關(guān)性；CC與細(xì)胞骨架、胞液、細(xì)胞質(zhì)、白細(xì)胞介素（IL）-12受體復(fù)合物、富含菲可林-1的顆粒腔等相關(guān)；MF與生長激素受體結(jié)合，細(xì)胞因子受體結(jié)合、非膜跨越蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等相關(guān)。由此推測，黑骨藤活性成分主要通過以上通路對AS起治療作用。

KEGG分析結(jié)果顯示，黑骨藤與AS通路主要富集在Th17細(xì)胞分化、癌癥的通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、JAK-STAT信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等。除此之外，與PI3K-AKT信號通路、IL-17信號通路、破骨細(xì)胞分化等也有較大的相關(guān)性。

2.6 分子對接 為了驗(yàn)證成分-靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，選主要成分前5位異丙基二烯酚、漢黃芩素、山奈酚、槲皮素、杠柳苷元為配體，核心靶點(diǎn)前5位STAT3、MAPK1、MAPK14、JAK2、JAK1為受體進(jìn)行分子對接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載得到藥物成分MOL2格式結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫選擇人類（Homo sapiens）基因，篩選出蛋白結(jié)構(gòu)，并下載pdb格式文件。利用pymol軟件將靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)去除水分子、提取配體等。之后的步驟在AutoDock可視化軟件Autodock Tools 1.5.7中完成，對接結(jié)果保存為pdbqt格式文件。利用Openbabel軟件把pdbqt格式轉(zhuǎn)換為pdb格式，最后將pdb格式文件導(dǎo)入Pymol軟件對最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。配體與受體的結(jié)合能小于-1.19 kcal·mol-1，表明具有一定的結(jié)合活性［8］，結(jié)合能越小說明兩者結(jié)合越穩(wěn)定。結(jié)果顯示，除異丙基二烯酚外，其余4種活性成分與JAK1結(jié)合能相對比較低，其中漢黃芩素結(jié)合能-6.59 kcal·mol-1為最低，與所有結(jié)構(gòu)對比為最優(yōu)結(jié)構(gòu)。見表4。

3 討 論

黑骨藤作為苗藥收錄于《中華本草苗藥卷》《全國中草藥匯編》等書籍，其味苦、辛，性溫，有小毒，具有通經(jīng)、活血、解毒、祛風(fēng)等功效。大量研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤含強(qiáng)心苷類、醌類、黃酮類、苯丙素類、萜類、甾體類、揮發(fā)油類及神經(jīng)酰胺類等多種化學(xué)成分［5-6］，具有較好的抗炎消腫與鎮(zhèn)痛作用［9-10］，常用于風(fēng)濕病的治療，能有效下調(diào)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等表達(dá)，緩解關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善軟骨退變及骨破壞［11］。張麗等［12］研究顯示，運(yùn)用五藤散（由大血藤、黑骨藤、雞血藤、桂枝、乳香等組成）督脈灸療法聯(lián)合功能鍛煉治療AS患者60例，總有效率達(dá)97.0%，患者脊柱活動和功能明顯改善，關(guān)節(jié)功能恢復(fù)，并優(yōu)于柳氮磺吡啶腸溶片觀察組。

3.1 黑骨藤主要活性成分 本研究選用黑骨藤12種

活性成分，結(jié)果顯示，主要發(fā)揮藥效的可能是漢黃芩素、山奈酚、槲皮素等化合物這些化合物，有很好的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抑菌等活性［13］。漢黃芩素可直接作用于免疫細(xì)胞，抑制IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［14］，BAUMANN等［15］研究證實(shí)，漢黃芩素可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與分化，減少Th17細(xì)胞形成，同時(shí)能促使活化的T細(xì)胞凋亡。并且通過抑制JAK1、JAK2、JAK3、STAT1和STAT3的磷酸化，阻斷JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少IL-7、IL-6和TNF-α等促炎因子分泌［16-17］，在疾病中發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。

3.2 黑骨藤作用于AS核心靶點(diǎn) PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，黑骨藤作用于AS主要以STAT3、MAPK1、MAPK14、JAK2、JAK1等為核心靶點(diǎn)。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）家庭成員，被受體相關(guān)激酶磷酸化后，易位至細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄激活劑發(fā)揮作用，在細(xì)胞生長、凋亡、激活和分化中起關(guān)鍵作用，可通過JAK/STAT、MAPK信號通路等參與AS患者成骨細(xì)胞分化和骨形成，是AS發(fā)病及病程中重要的樞紐基因［18］。MAPK1、MAPK14屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白，在多種生理和病理過程發(fā)揮作用，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激、炎癥以及免疫反應(yīng)等。MAPK信號通路被異常激活后可上調(diào)STAT3磷酸化水平［19］。Janus激酶（JAK）是一類非受體型酪氨酸蛋白激酶家族，包括JAK1、JAK2、TYK2和JAK3，JAK與STAT結(jié)合形成JAK/STAT通路，對調(diào)控免疫系統(tǒng)、促進(jìn)細(xì)胞生長、抗凋亡及促進(jìn)細(xì)胞周期等發(fā)揮重要作

用［20］。JAK1可直接磷酸化STAT，也通過與信號受體相關(guān)的其他JAK激酶的反式激活STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［21］。JAK2是一種非受體酪氨酸激酶，在細(xì)胞因子和生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起核心作用，募集并磷酸化STAT蛋白激活劑［22］。靶向JAK1/2治療被認(rèn)為是AS的有效治療方案之一［23］。研究證實(shí)，AS患者使用JAK抑制劑治療后，Th17細(xì)胞產(chǎn)生減少，IL-17、IL-22等蛋白表達(dá)明顯降低，AS病情得到改善［24］。

3.3 黑骨藤治療AS的主要通路 GO和KEGG分析顯示，黑骨藤作用于AS的核心靶點(diǎn)主要富集在JAK/STAT、Th17細(xì)胞分化等信號通路。同時(shí)，分子對接驗(yàn)證也顯示，化合物與靶點(diǎn)結(jié)合都比較穩(wěn)定，其中漢黃芩素與JAK1結(jié)合為最優(yōu)結(jié)構(gòu)。大量研究證明，JAK/STAT通路的失調(diào)與各種癌癥和自身免疫性疾病有關(guān)［25］，也參與了AS發(fā)病機(jī)制中促炎信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［26］。AS患者外周血單核細(xì)胞中JAK/STAT通路被高度活化，活化的STAT促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖與分化［27］，進(jìn)而增加下游炎性因子表達(dá)，引起一系列炎性反應(yīng)［28］。Th17細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞亞群輔助性T細(xì)胞（Th），Th細(xì)胞包括Th1、Th2、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）等，參與TNF-α、γ干擾素及多種IL，如IL-2、IL-17等分泌［29］。IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，Th17/IL-17炎癥軸已被確定是影響AS發(fā)展的重要因素［30］，因此，Th17細(xì)胞常作為AS預(yù)后的參考［31］。吳冬梅［32］研究證實(shí)，AS患者出現(xiàn)外周血Th17細(xì)胞異常分化現(xiàn)象，IL-17表達(dá)明顯升高，通過清熱利濕活血法治療可有效抑制Th17分化偏移，減少IL-17分泌，緩解AS炎癥。因此推斷黑骨藤對AS的治療主要通過漢黃芩素、山奈酚、槲皮素等活性成分，作用于STAT3、MAPK1、MAPK14、JAK2、JAK1等靶點(diǎn)，在JAK/STAT、Th17細(xì)胞分化等信號通路實(shí)現(xiàn)。分子對接顯示，漢黃芩素與JAK1結(jié)合良好，可能在治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析黑骨藤治療AS的作用機(jī)制，預(yù)測黑骨藤治療AS的有效成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路，結(jié)果顯示，其在AS治療上從多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮作用，為該藥物治療AS提供分子理論依據(jù)，同時(shí)也為后續(xù)研究提供新的方向。但是，此次研究側(cè)重于理論探討，上述結(jié)論尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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收稿日期：2023-08-27；修回日期：2023-10-11