苗藥萵比苷(商陸)不同炮制品對小鼠脾虛動物模型的影響

杜洪志 王先菊 陳志琳 孫興利 韓昌松 李瑋△

(1.貴州中醫藥大學藥學院,貴州 貴陽 550025;2.黔西南州中醫醫院,貴州 興義 562400;3.貴州中醫藥大學第一附屬醫院,貴州 貴陽 550001)

苗藥萵比苷(商陸)為商陸科植物商陸PhytolaccaacinosaRoxb.或垂序商陸PhytolaccaamericanaL.的干燥根。其生品性冷,味苦,屬冷藥,入熱經,有毒。具有洼沃(瀉水)、達洼渥(利尿)之功,主用于普嘎秋(水臌病)、崗秀布(皮膚濕疹)等病癥[1]。主要含有三萜皂苷類[2]、黃酮類[3]、多糖類[4]等化學成分,具有利尿[5]、抗菌消炎[6]、抗肝損傷[7]、增強免疫[8]等藥理作用。“飲片入藥,生熟異用”,既是中醫藥一大特色,也廣泛運用于民族醫藥的炮制[9]。萵比苷(商陸)藥用歷史悠久,始載于《神農本草經》,療效突出,但因其毒性,列為下品。故臨床上多炮制后入藥,以保證用藥的安全有效。2020版《中國藥典》收載炮制方法為“醋炙商陸”,炮制后作用緩和,苦寒之性降低,但仍有一定毒性。通過古代本草及民族藥專著考證,萵比苷(商陸)蒸熟后可內服。如《雷公炮炙論》記載“豆葉蒸制,從午至亥出,細銼用”,《千金翼方》記載“根苗并堪食,凈洗熟蒸,并無毒”,《中國民族藥炮制集成》記載“流水浸泡三天,甑內蒸12小時,可內服”。而在苗醫藥的臨床應用中,蒸制為熟品后,其味甘性補,不僅降低毒性,而且藥性和功效改變,成為苗藥中的補體藥,具有補虛健脾之功,為神疲乏力、體虛勞損的常用藥物[1]。此外,有商陸入“補”的文獻報道[10]。本研究主要探討苗藥萵比苷(商陸)不同炮制品對小鼠脾虛動物模型的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器BMJ-A型包埋機(常州郊區中威電子儀器廠);RS36型全自動染色機(常州派斯杰醫療設備有限公司);PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司);數字切片掃描儀(濟南丹吉爾電子有限公司);ME204E萬分之一分析天平(上海梅特勒—托利多儀器有限公司);HH-S4型恒溫水浴鍋(上海況勝實業發展公司);101-3AB型電熱恒溫鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);XL-02A型新型密封式粉碎機(廣州市旭朗機械設備有限公司)。

1.2 材料及動物蘇木素染液(珠海貝索生物技術有限公司);伊紅染液(珠海貝索生物技術有限公司);4%多聚甲醛通用型組織固定液(Biosharp生物公司);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(成都金山化學試劑有限公司,批號:20140302);無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司,分析純);蒸餾水為實驗室自制。參苓白術散(山西華康藥業股份有限公司,批號:國藥準字Z14020399);萵比苷(商陸)藥材采自貴州省貴陽市花溪區,經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為商陸科植物垂序商陸PhytolaccaamericanaL.的根。SPF級KM小鼠,體重18～22 g,合格證號SCXK(湘)20140011,購自長沙市天勤生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萵比苷(商陸)不同炮制品的制備

1.3.1.1 生品取萵比苷(商陸)鮮藥材,除去雜質,洗凈泥土,刮去外皮,趁鮮切厚片(0.2～0.4 cm),60℃烘干,取出,得生品樣品。

1.3.1.2 醋炙品取烘干后的凈萵比苷(商陸)片,根據2020版《中國藥典》中收載的商陸“醋炙法”,進行醋炙炮制。炒至表面黃棕色,微有醋香氣,取出,攤開放涼,得醋炙品樣品。

1.3.1.3 趁鮮蒸制取定量鮮萵比苷(商陸)片,大小分檔,置于蒸制容器中,用鮮大豆葉層層隔開,底部以及頂部覆蓋,一層大豆葉一層商陸片,隔水加熱,分別蒸制4、12、22、32 h,取出,冷卻,60℃烘干,得趁鮮蒸制樣品。

1.3.1.4 流水浸后蒸制取定量鮮萵比苷(商陸)片,流水浸泡3 d,取出,瀝干水,按“1.3.1.3”項蒸制法蒸制12 h。取出,冷卻,60℃烘干,得萵比苷(商陸)流水浸后蒸制樣品。

1.3.2 小鼠脾虛動物模型的建立

1.3.2.1 動物分組取SPF級KM小鼠130只,雌雄各半。適應性喂養3 d后。按隨機數字法選10只作為正常組,每日給適量飼料和飲水。其余120只分為九組進行造模,最終每組至少選擇10只合格模型小鼠進行藥效學試驗。

1.3.2.2 脾虛動物模型建立方法根據相關文獻[11-13],并結合前期預試驗,采用“大黃苦寒瀉下+飲食失節+勞倦過度”聯合法制備小鼠脾虛動物模型。(1)按0.2 mL/10 g·d-1給予0.5 g/mL的大黃水煎液,每日記錄小鼠體重體征、活動指數、大小便等,并進行形態學觀察。(2)每日定時置于溫水(30±2)℃中尾附重(2 g)游泳至力竭(以鼻尖沉入水面下達3次以上、或鼻尖沉入水面下5 s以上未能浮出水面為度)。(3)每日控制飲食,隔日喂食(隔日禁食不禁水,隔日足量給食),使饑飽失常。連續造模至小鼠出現“精神倦怠、懶動、毛色枯黃、便溏、泄瀉、食少,體重下降”等一系列類似中醫“脾虛”癥狀。該方法符合中醫“苦寒傷脾”、“勞則氣耗”、“饑飽失常"理論,可作為脾虛動物模型。

1.3.2.3 脾虛動物模型評價指標脾虛體征[11-13]:(1)精神怠倦,懶動,拱背,扎堆,瞇眼;(2)毛色枯黃,炸毛;(3)受驚無神,抓取時掙扎無力,便溏,泄瀉;(4)體重增長減慢或體重下降;(5)食量(飲食量和飲水量)減少等。結果連續造模23 d,90%小鼠全部出現相關脾虛體征。具體評價指標:(1)移動強度,不移動,觸之少動(1+);較少移動,觸之即動(2+);自主移動,觸之劇烈(3+);自主持續移動(4+);自主持續強烈移動(5+)。(2)是否拱背,是(√);否(×)。有且偶爾(1+);有且較明顯(2+);有且持續(3+);較明顯且持續(4+);明顯且持續(5+)。(3)是否扎堆,是(√);否(×),偶爾短暫不計。(4)是否瞇眼,是(√);否(×)。較弱(1+);明顯(2+);幾乎不睜眼(3+)。(5)毛發色澤,暗淡,有污穢且明顯(1+);較暗淡且有少許污穢(2+);無污穢(3+);較潔白(4+);潔白,有光澤(5+)。(6)毛發狀態,明顯炸毛,成縷(1+);少許炸毛或成縷(2+);未出現炸毛或成縷(3+);較柔順(4+);柔順,光滑,干燥(5+)。(7)受驚時反應,幾乎無反應(1+);反應較弱(2+);反應明顯,跑動(3+);反應強烈,不停跑動(4+);易驚,跳動(5+)。(8)掙扎力度,幾乎不掙扎(1+);掙扎較弱(2+);掙扎較強(3+);掙扎強烈,四肢抽動(4+);劇烈掙扎,撕咬(5+)。(9)便溏泄瀉,是(√);否(×)。肛門有少許糞便粘附、稍成條形,稍黏軟(1+);肛門有較明顯糞便粘附、不成條形,較黏軟(2+);肛門有明顯糞便粘附且濕溏、成團,濕黏(3+);糞便較稀溏,不成形,有固體(4+);糞便稀溏,完全不成形,量多(5+)。(10)游泳力竭,尾附重2 g,以鼻尖沉入水面下達3次(快速連續)、或鼻尖沉入水面下5 s未能浮出水面為力疲;水溫:(30±2)℃。

1.3.3 萵比苷(商陸)不同炮制品對小鼠脾虛動物模型的影響

1.3.3.1 動物分組將造模成功的KM小鼠平均分配到模型組、陽性藥對照組(簡稱“陽性組”)、生品組、醋炙組、流水浸后蒸制12 h組(簡稱“水浸組”)、蒸制4 h組、蒸制12 h組、蒸制22 h組、蒸制32 h組。

1.3.3.2 樣品提取與給藥取萵比苷(商陸)不同炮制品粗粉,分別加8、6倍50%食用乙醇回流提取3次,每次1 h后500目濾布過濾,合并濾液,60 ℃減壓回收溶劑,濃縮至干。根據2020版的《中國藥典》中萵比苷(商陸)的成人使用量及前期劑量篩選,分別用0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶解定容,使含生藥量為3.6 g/kg,4 ℃冰箱保存備用。參苓白術散為陽性對照藥,根據成人用量,給藥濃度為0.36 g/mL。正常組和模型組給予0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液,各組按0.1 mL/10 g口服灌胃給藥,每日早晚各1次。在給藥期間每日中午按0.2 mL/10 g·d-1給予0.5 g/mL的大黃水煎液。

1.3.3.3 小鼠體征指標觀察給藥后,根據表1相關評價指標,每日觀察并記錄小鼠體征,如精神怠倦、拱背瞇眼、畏寒扎堆、毛色狀態、受驚反應,便溏泄瀉等。

表1 萵比苷(商陸)不同炮制品對脾虛模型小鼠外觀體征的影響(n=11)

1.3.3.4 負重游泳時間及臟器指數測定連續給藥12 d后,在解剖前對各組小鼠進行負重游泳,并記錄其力竭時間。同時,將小鼠進行藥理解剖,取心、肝、脾、肺、腎等臟器。并計算小鼠臟器指數:臟器指數/%=臟器濕重/大鼠體重×100%。

1.3.3.5 病理切片觀察連續給藥12 d后,取小鼠脾臟組織,采用HE染色,對脾虛動物模型脾臟組織進行病理切片檢查,觀察各給藥組對小鼠脾臟細胞的影響。

2 結 果

2.1 小鼠脾虛體征蒸制品可明顯改善小鼠脾虛動物模型的外觀體征,其中以蒸制12 h的綜合改善作用較強,而生品組和醋炙組的改善作用較弱,見表1;以正常體征為改善率100%,各脾虛體征改善程度“1+”為2.5個百分點,得到各組脾虛體征改善率折線圖。見圖1。

圖1 萵比苷(商陸)不同炮制品對脾虛模型小鼠外觀體征的改善

2.2 負重游泳時間與模型組比較,蒸制12、22、32 h三個組負重游泳時間明顯增加(P<0.05),其中以蒸制12 h作用較強(P<0.05),而生品組和醋炙組負重游泳時間較短(P<0.05)。見圖2。

2.3 臟器指數與空白組比較,模型組的心臟、脾臟和生殖器具有顯著性差異(P<0.05),與模型組比較,蒸制12 h后的體質量、心臟、膽、腎臟、胸腺具有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

2.4 脾臟組織模型組小鼠脾臟組織脾小體萎縮、發生中心或邊緣區擴張,淋巴細胞減少等病理變化。與空白組比較,生品組脾小體部分萎縮,淋巴細胞相對較少;與模型組比較,蒸制4 h基本正常,而蒸制12、22、32 h脾臟被膜完整,白髓紅髓分界較為清晰,白髓脾小體淋巴細胞數量明顯增多,增強脾臟免疫功能,紅髓內各細胞未見明顯異常,脾血竇未見淤血擴張,未見其他病理改變。見圖3。

3 討 論

苗藥萵比苷(商陸)經蒸制之后,可明顯改善小鼠脾虛動物模型中“懶動、便溏、泄瀉、扎堆瞇眼”等相關體征,增加小鼠負重游泳時間,且在一定范圍內,與蒸制時間呈正相關,但久蒸會使藥效減弱,以蒸制12 h為宜。與陽性藥參苓白術散比較,萵比苷(商陸)蒸制12 h后可明顯改善小鼠脾虛動物模型,其作用接近于陽性藥,而傳統炮制方法中醋炙品及生品則無明顯作用。研究結果表明,萵比苷(商陸)蒸制后,可明顯改善小鼠脾虛動物模型的各項體征,且作用效果與蒸制時間密切相關。

蒸制法為中藥及民族藥炮制中常用的藥材加工方法,其歷史悠久,最早可追溯至《五十二病方》,“蒸羊尼”、“蒸凍土”、“陳藿,蒸而取其汁”均為蒸制法的記載。藥物蒸制后,可達到減毒增效、改變藥性的炮制目的,故廣泛應用于中藥黃精、地黃[14]及民族藥土黨參[15]等藥物炮制中。根據課題組前期研究[16],苗藥萵比苷(商陸)不同蒸制法對藥材內在成分的影響較大,長時間蒸制后趨于穩定。結合本實驗研究,不同蒸制時間樣品,可不同程度改善小鼠脾虛動物模型,結果表明蒸制對內在成分(組分)的影響可引起藥效的不同。然藥物蒸制過程其內在物質的變化或變化規律與藥效的相關性,以及該民族藥炮制前后減毒入“補”的作用機制,有待進一步的深入研究論證。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過貴州中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準,本研究不涉及知情同意。