二甲雙胍調節AMPK/TGF-β1信號通路對百草枯中毒大鼠肺纖維化的保護作用

吳潦章 楊瑾 王凈 岑遺芳 華維 駱付麗 潘萬福

(遵義醫科大學附屬醫院急診科,貴州 遵義 563003)

百草枯(Paraquat,PQ)是一種在全球農業生產中應用比較廣泛的非選擇性觸殺型除草劑[1],對人類和其他哺乳動物具有劇毒。由于PQ缺乏特效解毒藥,中毒后病死率可達50%～70%[2]。肺纖維化是PQ中毒后期最主要的并發癥及死亡原因。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種在真核生物中具有能量調節作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[3]。除了能量調節,AMPK還有抗氧化應激[4]和減輕纖維化形成的作用[5]。有研究[6]報道,降糖藥物二甲雙胍(Metformin,MET)可以通過抑制電子傳遞鏈復合物Ⅰ減少細胞內能量來激活AMPK。本課題組在前期實驗研究也發現二甲雙胍可激活AMPK信號通路,明顯減輕PQ中毒大鼠肺組織炎癥反應及急性肺損傷[7]。但對于二甲雙胍是否在PQ所致肺纖維化中也起同樣的保護作用以及通過哪條信號通路發揮的作用,尚不清楚。本研究旨在探討MET通過激活AMPK信號通路對急性PQ中毒致大鼠肺纖維化的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年SPF級雄性SD大鼠30只,體重(200±20)g,購自長沙市天勤生物技術有限公司,實驗動物許可證號:SCZK(黔)2021-0002。飼養于遵義醫科大學實驗動物中心[20～25℃,(50±5)%相對濕度,12 h晝夜循環光照],給與標準食水喂養,開始實驗前至少飼養1周。所有實驗動物在飼養及實驗過程中均符合遵義醫科大學動物倫理要求。

1.2 主要材料20%百草枯溶液(南京紅太陽生物化學有限責任公司);鹽酸二甲雙胍(美國Sigma-Aldrich公司);復合物C、AICAR(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);SOD、MDA和GSH-px試劑盒(南京建成生物工程研究所);Masson染色試劑盒、Hyp檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔抗鼠p-AMPK-α1抗體、兔抗鼠 TGF-β1抗體、兔抗鼠 E-cadherin抗體、兔抗鼠α-SMA 抗體、兔抗鼠β-actin抗體(北京博奧森生物技術有限公司);化學發光熒光成像系統(美國Bio-Rad公司);全自動多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 動物分組按隨機數字表法將30只大鼠隨機分為五組:對照組(Control組,n=6)、PQ中毒組(PQ組,n=6),二甲雙胍干預組(PQ+MET組,n=6),腺苷類似物組(PQ+AICAR組,n=6)和復合物C組(PQ+MET+CC組,n=6)。

1.4 模型建立將20%百草枯溶液加0.9%生理鹽水稀釋為2%的溶液(濃度20 mg/mL),避光保存。按30 mg/kg 抽取2%的百草枯溶液并用0.9%生理鹽水稀釋為1 mL一次性腹腔注射,制備PQ中毒的實驗模型。MET干預組從染毒后2 h開始,給予400 mg/kg MET灌胃,1次/天,共21 d。腺苷類似物組每日灌入AICAR 200 mg/kg。AMPK抑制劑組予以MET 400 mg/kg灌胃并腹腔注射復合物CC 20 mg/kg。PQ組每日灌入等量0.9%生理鹽水。Control組用等量0.9%生理鹽水一次性腹腔內注射,并每日灌入等量0.9%生理鹽水。各組大鼠均在21 d時處死,并收集肺組織標本。

1.5 大鼠肺組織勻漿中氧化指標和Hyp的檢測大鼠予1%戊巴比妥鈉(10 mL/kg)腹腔注射麻醉充分后,仰面固定于恒溫手術臺上,采用斷頸法處死大鼠,收集肺組織標本。按照超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)試劑盒說明書,分別采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD 的活力、硫代巴比妥酸法檢測MDA 的含量和化學法測定GSH-px和Hyp水平。

1.6 肺組織病理學檢查取大鼠右下葉肺組織,用4%多聚甲醛固定72 h,石蠟包埋、切片,脫蠟后,切片用Masson染色,在光學顯微鏡下觀察各組肺組織病理學變化。

1.7 肺組織透射電鏡檢查大鼠麻醉后,立即開胸,充分暴露雙肺,快速剪取左肺下葉一小塊肺組織,固定于2.5%戊二醛中,并修剪成1 mm3大小,4 ℃固定4 h以上,加入1%鋨酸后固定1.5 h,用不同濃度乙醇和丙酮梯度脫水,浸透、包埋、修塊、切片和染色,置于透射電鏡下觀察組織結構變化。

1.8 Western-blotting分析大鼠肺組織加人適量RIPA裂解后,12 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液,用BCA法測定蛋白濃度,加人1/4(v/v)的loading Buffer,100℃ 5 min變性蛋白。每條泳道中加人20 μg總蛋白的蛋白樣品,進行SDS-PAGE電泳。電泳完成后,在300 mA,70 min條件下轉膜至PVDF微孔膜,用5%脫脂奶粉或3%BSA的TBST封閉液常溫封閉2 h,然后加入相應的一抗封閉液稀釋的抗體,4 ℃過夜孵育,用TBST洗滌膜15 min,共3次。二抗常溫振蕩孵育2 h,用TBST洗滌膜15 min,共3次。將發光液A、B混合液均勻滴到膜上,置于Bio-rad凝膠成像系統成像,Western-blotting結果經Image J軟件進行灰度掃描分析。

2 結 果

2.1 PQ中毒大鼠行為學變化PQ組大鼠在給藥72 h后出現毛發松散不光澤、呼吸急促,活動、進食減少;對照組大鼠一般狀況良好,未出現上述癥狀;MET干預組毛發松散程度、呼吸、活動、進食較PQ組有所好轉。

2.2 Hyp含量經Hyp試劑盒檢測,與對照組比較,PQ組大鼠肺組織中Hyp明顯增加(P<0.05);與PQ組比較,PQ+MET組與PQ+AICAR組肺組織中Hyp含量明顯減少(均P<0.05),與PQ+MET組比較,PQ+MET+CC組大鼠肺組織中Hyp含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量變化

2.3 SOD、MDA和GSH-px水平變化與對照組相比,PQ組大鼠肺組織勻漿中MDA含量明顯升高(P<0.05),而SOD和GSH-px明顯降低(P<0.05);與PQ組比較,PQ+MET組與PQ+AICAR組大鼠肺組織勻漿中MDA含量明顯降低(P<0.05),而SOD和GSH-px均明顯高于PQ組(均P<0.05),但兩干預組間差異無統計學意義(P>0.05);與PQ+MET組相比,PQ+MET+CC組大鼠肺組織勻漿中的MDA明顯升高(P<0.05),而SOD和GSH-px明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿中MDA、SOD和GSH-px的變化

2.4 肺組織病理學觀察Masson染色的組織切片顯示,對照組大鼠肺組織結構清晰,肺泡壁未見增厚,未見藍染膠原纖維沉積;PQ組大鼠肺組織呈明顯的纖維化改變,肺泡壁增厚,支氣管周圍及肺泡間隔的膠原纖維增多(藍色部分),部分肺泡結構破壞,成纖維細胞增生、肥大;與PQ組相比,PQ+MET組與PQ+AICAR組,見大鼠肺泡結構完整、未見大量藍染膠原纖維沉積,肺組織纖維化顯著減輕;但是,PQ+MET+CC組大鼠肺組織仍出現了嚴重的結構破壞及明顯的纖維化改變(見圖1)。在透射電鏡下,對照組大鼠肺組織結構清晰,未見膠原纖維形成;PQ組大鼠肺泡壁、肺泡腔擠壓變形,支氣管周圍及肺泡間隔的膠原纖維增多,基質增厚,肺泡結構破壞;同時間PQ+MET組與PQ+AICAR組上述表現明顯減輕;但PQ+MET+CC組仍出現了肺泡結構破壞及纖維化改變(見圖2)。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(Masson×200)

圖2 各組大鼠肺組織病理變化(透射電鏡×20000)

2.5 大鼠肺組織中蛋白表達情況與對照組相比,PQ組大鼠肺組織中的α-SMA蛋白含量更高,E-cadherin蛋白含量更低;與PQ組相比,PQ+MET組與PQ+AICAR組E-cadherin蛋白表達增加,α-SMA蛋白表達減少;與PQ+MET組相比,PQ+MET+CC組肺組織中的E-cadherin 蛋白表達量減少、α-SMA 蛋白表達量升高;以上差異均具有統計學意義(P<0.05);與對照組相比,PQ 組大鼠肺組織中的 TGF-β1蛋白表達增加;與PQ組相比,PQ+MET組與PQ+AICAR組大鼠肺組織中的Phospho-AMPK蛋白表達量明顯增加,而TGF-β1蛋白表達量明顯減少;與PQ+MET組相比,PQ+MET+CC組肺組織中的Phospho-AMPK蛋白水平表達減少,而TGF-β1蛋白表達量增加;各組差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注:與Control組比較,*P<0.05;與PQ組比較,#P<0.05;與PQ+MET組比較,&P<0.05。圖3 各組大鼠肺組織中蛋白表達變化

3 討 論

肺纖維化是百草枯中毒后最主要的死亡原因,目前雖然有許多關于百草枯中毒引起肺纖維化的研究報道,但其具體的發病機制尚未完全闡明,缺乏有效的治療方法。近年來的研究表明肺纖維化的病理特征包括大量的肌成纖維細胞堆積和肺泡內的細胞外基質沉積[8]。成纖維細胞中的α-平滑肌肌動蛋白促進其在纖維化病灶中產生過量的膠原蛋白[9],過量的膠原蛋白將導致細胞外基質過度沉積,這是造成肺纖維化的主要原因。羥脯氨酸是膠原蛋白所特有的一種氨基酸,可反應肺組織纖維化的嚴重程度。本實驗通過建立PQ中毒大鼠肺纖維化模型,證實了PQ染毒大鼠肺組織Masson染色可見肺泡壁增厚,支氣管周圍及肺泡間隔的膠原纖維增多,透射電鏡下可見大鼠肺泡壁、肺泡腔擠壓變形、基質增厚及膠原纖維增多,肺組織勻漿中Hyp的含量明顯升高,這與前人研究相一致。而經過MET干預后,上述情況均有所改善。

MET作為治療2型糖尿病的一線降糖藥,除了發揮降糖作用,還能激活AMPK發揮抗纖維化[10]和減少氧化應激[11]。在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型上,二甲雙胍通過上調AMPK通路治療性地加速肺纖維病灶的溶解。AMPK通路下調,可加速病理性纖維化的形成過程,而二甲雙胍則通過上調AMPK通路逆轉了肺纖維化過程[12]。我們為了探討MET在PQ誘導肺纖維化中的作用,復制了國內外常見的PQ誘導的大鼠肺纖維化模型[13],并在前期研究基礎上,選定MET400 mg/kg作為實驗干預劑量[7],以觀察MET在PQ誘導的肺纖維化中可能發揮的作用。實驗證實MET能明顯改善PQ引起的肺纖維化,減輕氧化應激。與PQ組大鼠比較,PQ+MET組肺組織勻漿中Hyp含量明顯降低,Masson染色及透射電鏡下肺組織病理改變減輕,肺組織勻漿中氧化產物MDA含量也相應降低。同時,經過MET處理后,可以提高大鼠肺組織勻漿中抗氧化物SOD和GSH-px的表達。我們都知道,PQ誘導的氧化應激中,主要表現為氧化產物MDA含量增加,和抗氧化物SOD、CAT和GSH-px水平降低,這已經在許多實驗中被證實[14]。這些實驗結果說明MET在PQ誘導的肺纖維化中可以減輕肺組織的過氧化損傷及纖維化程度。

上皮—間質轉化是 PQ 導致的肺纖維的一個重要病理改變過程,其中轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-1, TGF-β1)在上皮—間質轉化過程中起著核心作用[15]。TGF-β1是纖維化的主要內源性調節因子,其表達在肺纖維化病變中普遍升高[16]。抑制 TGF-β1 相關信號轉導通路的活化可以改善上皮-間質轉化過程及肺纖維化的程度。在百草枯誘導肺纖維化模型中,TGF-β1 mRNA的表達逐漸增加,在第7天達到峰值。TGF-β1的增加先于Ⅰ型膠原和α-SMA mRNA表達的增加,這是纖維化的一個指標[17]。促纖維化蛋白TGF-β1和α-SMA的顯著升高促進了肺泡塌陷和肺組織膠原沉積[18]。在本次研究中,我們檢測了肺組織中的TGF-β1、E-cadherin和α-SMA蛋白的表達作為纖維化進展和上皮-間充質轉化的標志物。研究表明,PQ可導致大鼠肺組織中TGF-β1和α-SMA 蛋白水平增高,及E-cadherin蛋白水平的降低。而MET和AMPK激活劑 AICAR 均在一定程度上減輕了PQ誘導的這一改變。同時,在加入AMPK抑制劑復合物C以后,這一作用受到抑制。也就是說二甲雙胍干預顯著抑制了TGF-β1誘導的肌成纖維細胞分化和上皮-間充質的轉化,這一過程是通過激活AMPK介導的。有報道[19]稱,二甲雙胍可通過介導AMPK抑制TGF-β1/Smads信號通路改善慢性結腸炎相關腸纖維化。同時,S.Thakur等[20]研究表明,二甲雙胍激活AMPK可降低TGF-β1誘導的α-SMA和纖連蛋白表達。這與我們的實驗結果相一致。

綜上所述,二甲雙胍可以減輕PQ中毒大鼠肺纖維化,其機制與激活AMPK信號通路,下調TGF-β1來改善上皮-間質轉化有關,而這一效應可以被AMPK抑制劑CC所抑制。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過遵義醫科大學附屬醫院倫理委員會批準,為動物實驗故知情同意免除。

貢獻度說明

吳潦章負責實驗設計、撰寫論文,楊瑾、王凈、華維、駱付麗、潘萬福進行實驗實施,岑遺芳進行數據整理。