牙膏中三七皂苷TLC定性檢測法的改進

陳玉玲

(云南諾特金參口腔護理用品有限公司,云南 昆明 650212)

引言

三七藥物牙膏已有近四十年的歷史,呵護了幾代云南人的口腔健康。云南三七牙膏秉承三七藥物牙膏而來,采用云南文山道地藥材三七提取物,內含活性成分,保留三七止血功能的同時,專注口腔護理,秉承藥物牙膏的工藝積淀。

《本草綱目》中記載:三七具有“止血、散血、定痛”的功效, 又名“金不換”。藥用成分主要是三七總皂苷[1], 三七總皂苷又包含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1等成分, 具有消炎、消腫、止血、鎮痛的作用[2]。研究表明含三七的中藥牙膏可以幫助減輕口腔潰瘍、牙菌斑、牙齦炎和牙齦出血等[3～6]。

云南三七牙膏為磷酸氫鈣與二氧化硅復配體系,區別于大多數牙膏類型,且功效型牙膏行業標準QB/T 2966-2014附錄F——人參皂苷、三七皂苷薄層的色譜鑒別方法出臺時間已經相對較久,《中國藥典》也已經更新至2020版本,很多檢測方法也已改進。為了檢測結果更加準確,便于平時檢測需要,特針對云南三七牙膏中三七皂苷的TLC檢測法進行了研究及改進。

1 實驗材料

1.1 實驗材料和試劑

本實驗所采用的的牙膏均為三七牙膏(云南諾特金參口腔護理用品有限公司出品);對照品:110703人參皂苷Rg1、110704人參皂苷Rb1、110754人參皂苷Re、110745三七皂苷R1(中國食品藥品檢定研究院制造,北京中科質檢生物技術有限公司供貨)。

石油醚(沸程60℃～90℃)、石油醚(沸程30℃～60℃)、氫氧化鈉0.1mol/L(1→20)、無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司);濃硫酸、甲醇(成都市科隆化學品有限公司);三氯甲烷(利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司);正丁醇(天津市致遠化學試劑有限公司);乙酸乙酯(天津市恒興化學試劑制造有限公司);中性氧化鋁(天津市風船化學試劑科技有限公司);純化水。

1.2 實驗儀器與設備

層析缸、層析柱、分液漏斗、抽濾瓶、G3坩堝、毛細管、硅膠G薄層板(50*100mm青島海洋化工廠分廠);分析天平(AUX120島津企業管理(中國)有限公司);恒溫磁力攪拌器(85-2,常州國華電器有限公司);雙頻超聲波清洗機(SY3200DH,上海聲源超聲波儀器設備有限公司);循環水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ),鞏義市予華儀器有限責任公司);電子恒溫水浴鍋(DZKW-4,北京中興偉業儀器有限公司);電熱鼓風干燥箱(GZX-9030MBE,上海博迅實業有限公司醫療設備廠);超純水機(LYLSUPTC-20L,上海力辰邦西儀器科技有限公司)。

2 實驗步驟

2.1 試劑和層析柱的制備

水飽和的正丁醇溶液:將正丁醇與水(1∶1)混合,搖勻,放置過夜(超聲波10min即可)取上層。

硫酸乙醇(1→10)溶液:取10ml濃硫酸加入100ml容量瓶,緩慢加入無水乙醇至刻度線即可。

使用中性氧化鋁濕法裝柱,柱高5～7cm,適當壓實,無斷柱,無氣泡空洞產生最佳。

2.2 對照品溶液的制備

取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rg1對照品及三七皂苷R1對照品,加甲醇制成每1ml各含0.25mg的混合溶液,作為對照品溶液。

2.3 改進前樣品的制備及測定

按照功效型牙膏行業標準(QB/T 2966-2014)所寫的實驗方法進行實驗時發現,在加入石油醚去除表面活性劑K12時會產生大量乳白色化合物,初次蒸干后仍然殘留部分CMC或黃原膠,且展開劑在常溫下無法明顯展開,在紫外燈照射下無法顯出熒光點。針對這一實驗結果,做出了后續調整。

2.4 改進試驗

2.4.1 石油醚及萃取次數的選擇

功效型牙膏行業標準(QB/T 2966-2014)中所用石油醚為沸程60℃～90℃,目前K12標準中所用石油醚為沸程30℃～60℃,為更好地在萃取過程中除去牙膏中的K12, 還應增加萃取次數,以萃取過程和萃取結束的感官為評價標準,選出適宜的結果。

2.4.2 展開劑的選擇

實驗2.2中所用的展開劑三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶0.5)在觀察實驗結果時發現無法展開各個點位,更換展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10),以分離度為評價標準,選出合適的展開劑。

2.4.3 展開劑溫度的選擇

實驗2.2.3中選出的展開劑均在常溫下展開,發現點位不清晰,控制展開劑溫度在5℃、10℃、15℃下展開,以點位和顯色是否清晰為評價標準,選出適宜的溫度。

2.4.4 乙醇洗脫液濃度的選擇

對比30%、35%、50%的乙醇洗脫出的單獨點板檢測,以皂苷熒光點個數為評價結果,選出適宜的乙醇濃度。

2.5 新TLC檢測方法的確定

為了驗證所選出的4個條件是否適宜,故進行重復性實驗,以硅膠板上所顯點位及個數與對照品對比結果,得出適用于三七牙膏中三七皂苷的TLC檢測方法。

3 實驗結果

3.1 石油醚及萃取次數的選擇

由表1可知,石油醚的選擇及萃取次數對實驗過程影響較大,選擇60℃～90℃萃取3次后再用30℃～60℃萃取2次,所得到的試樣溶液效果最好。

表1 石油醚及萃取次數的選擇結果

3.2 展開劑的選擇

由表2和圖1、圖2可知,所選展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的分離效果更好。

表2 展開劑的選擇結果

圖1 展開劑1的展開效果

圖2 展開劑2的展開效果

3.3 展開劑溫度的選擇

由表3及圖3、圖4、圖5可知,在展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的情況下,在5℃下展開的薄層板點位顯色較清晰。

表3 展開劑溫度的選擇結果

3.4 乙醇洗脫液濃度的選擇

由表4及圖6、圖7、圖8可知,不同濃度的乙醇洗脫會對稀有皂苷的熒光點有影響,濃度低或高都會使得稀有皂苷熒光點消失,所以采用濃度為35%的乙醇洗脫效果最好。

表4 乙醇洗脫液濃度的選擇結果

3.5 新TLC檢測方法的確定

由以上實驗選出的最佳條件,得出適用于三七牙膏中三七皂苷TLC檢測方法,結果如圖9所示。

即:稱取牙膏25g,置于100ml錐形瓶中,加入95%乙醇60ml,用磁力攪拌器攪碎牙膏,使之均勻后,超聲波30min～1h。靜置后,上清液用G3坩堝抽濾,用95%乙醇40ml分兩次洗滌濾渣,并抽濾。濾液置于蒸發皿中,在90℃水浴鍋上濃縮至粘稠狀物。加水30ml溶解,轉移至60ml分液漏斗中,石油醚(沸程60℃～90℃)萃取3次,(沸程30℃～60℃)輕搖法萃取2次,每次用量20ml。棄去石油醚層,水層用水飽和的正丁醇萃取3次,使用正常萃取手法,每次用量50ml、25ml、25ml,棄去水層,上層溶液置于蒸發皿中, 在90℃水浴鍋上蒸發干,冷卻后殘渣加水10ml溶解,水溶液上中性氧化鋁層析柱。先用pH值為10左右的氫氧化鈉0.1mol/L(1→20)100ml溶液洗脫,再用300水,最后使用35%乙醇40～60ml洗脫,收集35%乙醇洗脫液置于蒸發皿中,在90℃水浴鍋上蒸發干,殘渣加1ml甲醇溶解,作為供試樣品待用。

按照薄層色譜法(通則0502)試驗,毛細管吸取上述兩種溶液各1μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑,5℃下展開,取出,快速烘干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品中主要成分的色譜點,在與對照品色譜點相應的位置上,顯相同顏色的斑點;置紫外光燈(365nm)下檢視,顯相同的熒光斑點。

a :對照品點,b c d e :供試品點

4 結論

該研究以磷酸氫鈣與二氧化硅復配體系牙膏(三七牙膏)為例,在缺少高效液相色譜儀的情況下,以薄層色譜法來驗證產品是否符合配方要求,經過與行業標準不同的嘗試實驗,最終得出適宜三七牙膏的TLC檢測法,為藥物牙膏的質量又增添了一份保障。但需要注意無論在石油醚萃取或水飽和正丁醇萃取時,使用正常萃取手法輕搖幾下即可,不可用力過猛,以免造成過多的損失,影響實驗結果。

隨著各行各業對自己產品質量越來越重視,即使在設備不足的情況下,也應該嚴格把控好自己的產品質量,才能在激烈的競爭中立于不敗之地。