影響豬精液常溫保存效果的因素分析及改進(jìn)技術(shù)

李暉

（湖南省衡東縣畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心 湖南衡陽 421400)

2021、2022 年我國的豬肉產(chǎn)量分別為5 295.93 萬和5 541.00萬t，年底生豬存欄量分別為44 922.42 萬和45 256.00 萬頭，這些數(shù)據(jù)表明隨著經(jīng)濟(jì)和相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我國養(yǎng)豬業(yè)也由傳統(tǒng)、落后的散養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)?；⒓s化、標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化的養(yǎng)殖，而在現(xiàn)代化養(yǎng)殖過程中，常用的繁育技術(shù)包括人工授精和精液保存技術(shù)。精液保存技術(shù)是應(yīng)用人工授精技術(shù)進(jìn)行繁育時較為重要的環(huán)節(jié)之一，其精液質(zhì)量的好壞直接影響到母豬的受胎率和仔豬的成活率，但是精液在保存過程中又易受到各種因素的影響，如溫度、pH、稀釋倍數(shù)、活性氧等。因此在充分了解到影響豬精液常溫保存效果因素的基礎(chǔ)上，如何通過改進(jìn)措施來延長精液的保存時間、保證精液的質(zhì)量至關(guān)重要。

1 影響豬精液常溫保存的因素

在體外常溫保存的豬精液易受到各種因素的影響，導(dǎo)致其精液質(zhì)量下降。常見的影響因素包括溫度、pH、稀釋倍數(shù)、活性氧、微生物等。

1.1 溫度

溫度會直接影響精液的品質(zhì)和精子的活力，是精液是否保存成功的關(guān)鍵。從精液的采集、稀釋、分裝、運輸?shù)阶罱K的使用均會受到外界環(huán)境的影響。若溫度過高則會導(dǎo)致種公豬的性欲低下并對精液品質(zhì)造成直接影響，當(dāng)外界溫度過低則會導(dǎo)致精子產(chǎn)生冷休克。因此在對豬精液進(jìn)行保存時，一定要做好溫度的控制，一方面要避免溫度波動過大對精液造成不可逆的影響，另一方面要保證適宜的外界溫度，避免過高或過低。一般情況下最適宜的豬精液常溫保存溫度為16～18℃[1]。此外，季節(jié)的選擇在一定程度上也會通過影響溫度而影響精液的品質(zhì)，夏季溫度過高則會降低精子的細(xì)胞質(zhì)膜、頂體完整性，增加精子的畸形率從而影響精液的質(zhì)量。

1.2 pH

為了減緩精子的代謝活動延長保存時間一般適合豬精液的pH 值為弱酸性（6.4～6.5 之間）。當(dāng)精液中大量的精子死亡、受到微生物污染時會導(dǎo)致精液的pH 值升高；當(dāng)精子過度的運動就會產(chǎn)生大量的乳酸和二氧化碳而導(dǎo)致pH 降低，pH 值過高或者過低均會導(dǎo)致精子的活性下降。

1.3 稀釋倍數(shù)

作為影響精液質(zhì)量的因素之一，稀釋倍數(shù)過大或者過小均會影響精子的存活時間和質(zhì)量。因為不同學(xué)者的研究結(jié)果不同，所以具體的稀釋倍數(shù)還需要綜合考慮各種因素。當(dāng)稀釋倍數(shù)過大時，會導(dǎo)致精清中蛋白質(zhì)濃度、抗氧化物質(zhì)的濃度等均降低而無法維持精子正常的運動和精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，無法起到保護(hù)精子的作用；當(dāng)稀釋倍數(shù)過小時則會導(dǎo)致精子的密度較大，代謝所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)較多，并且其代謝所產(chǎn)生的過多的代謝產(chǎn)物不利于精子的存活，從而縮短精子的保存時間。適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，既能夠為精子提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，還能夠消除副性腺分泌物對精子產(chǎn)生的有害影響，從而保證豬精液在常溫保存下的質(zhì)量[2]。

1.4 活性氧

精液中積累的活性氧濃度是威脅精子質(zhì)量的重要因素之一，而產(chǎn)生活性氧的途徑為精子的氧化磷酸化。適量的活性氧能夠使精子發(fā)生頂體反應(yīng)并使鈣離子的濃度增加，精子獲能從而協(xié)助精子成功受精。當(dāng)活性氧的濃度過高時會通過氧化精子質(zhì)膜使其表面的膽固醇流失而損傷精子的DNA 從而使得細(xì)胞質(zhì)外流最終導(dǎo)致精子的死亡。當(dāng)活性氧的濃度過低時則會導(dǎo)致精子不能獲能。

1.5 微生物

微生物降低精液質(zhì)量主要體現(xiàn)在兩個方面：一方面，微生物會和精子細(xì)胞競爭精液中的營養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致精子無法獲得足夠維持正常生命活動所需的營養(yǎng)，抑制了精子代謝；另一方面，大量微生物會產(chǎn)生較多的代謝廢物從而對精子產(chǎn)生毒害作用。此外，精液中攜帶的微生物也可能對進(jìn)行跨區(qū)域輸精的企業(yè)的生物安全造成威脅[3]。

2 改進(jìn)措施

2.1 保證適宜的溫度

首先要確定采精時間，為了避免夏季的熱應(yīng)激、冬季的冷應(yīng)激，一般選擇春季和秋季為最佳的采精時間；然后要控制好豬舍內(nèi)的室溫，避免溫度波動過大影響精液質(zhì)量，一般種公豬圈舍的溫度維持在18～24 ℃即可；接著要控制好精子各環(huán)節(jié)流通之間的溫度，包括提前配置好的適宜溫度的稀釋液、保溫泡沫箱、恒溫箱等。一般常溫保存豬精液的溫度為16～18 ℃，當(dāng)溫度低于14 ℃或者高于18 ℃時均會縮短精液的保存時間。

2.2 最適的pH 值

為了保證精液的pH 值維持在適宜范圍內(nèi)，可以通過添加緩沖液等來調(diào)節(jié)pH 值。常用的緩沖液包括碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、Tris 緩沖液、HEPES 緩沖液等，這些緩沖液均可以對精子生存的環(huán)境起到穩(wěn)定維持作用，防止精液中過酸的環(huán)境造成精子的死亡。

2.3 確定最佳稀釋倍數(shù)

在對精液進(jìn)行稀釋時要綜合考慮，一方面要考慮到稀釋后精液的體積，另一方面要考慮到人工授精時所需要的精子的數(shù)量。當(dāng)使用人工授精技術(shù)時，為了保證每頭母豬的受精精子數(shù)達(dá)到3.0×109～4.0×109/mL、所用的精液量為80～100 mL，需要使用的精液濃度為3.0×107～5.0×107個/mL[4]。

2.4 添加抗氧化劑

通過使用外源性的抗氧化劑可以在一定程度上減少精液中產(chǎn)生的活性氧對精子造成的氧化應(yīng)激?？寡趸瘎┑姆N類較多，不同種類的抗氧化劑其作用機(jī)理、添加劑量、作用效果也不同。廣大養(yǎng)殖戶可以根據(jù)具體情況選擇合適的抗氧化劑。

1）谷胱甘肽過氧化物酶。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）是一種重要的抗氧化酶，主要存在于生物體內(nèi)。它可以將還原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione，GSH）作為電子供體，將過氧化氫等有害的活性氧分子還原成水和相應(yīng)的醇，從而保護(hù)精子不受氧化損傷。當(dāng)前市面上有多種GPx 添加劑，應(yīng)選擇質(zhì)量穩(wěn)定、添加劑量易控制的產(chǎn)品。其次根據(jù)GPx 的活性、精液的質(zhì)量和保存條件等因素進(jìn)行計算，一般建議添加劑量為每毫升精液0.1～0.5 IU。最后添加GPx 的時間應(yīng)在精液采集后盡快進(jìn)行，避免精液暴露在空氣中過久而引起氧化損傷，添加后應(yīng)充分?jǐn)嚢杈鶆?，確保其充分分散在精液中，達(dá)到有效保存的目的。

2）褪黑素。褪黑素是一種常見的具有較強(qiáng)抗氧化作用的抗氧化劑。孫琳琳[5]研究了褪黑素對豬精液常溫保存效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將10 μmol/L 的褪黑素添加到豬精液時，精子的活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率等指標(biāo)均顯著高于未添加褪黑素的精液組，且精子內(nèi)氧自由基的水平、脂質(zhì)過氧化損傷水平均被顯著降低，而線粒體膜電位、ATP 含量以及總抗氧化能力被顯著提高。此外精子中一些凋亡蛋白的表達(dá)量（Cleaved Caspase-3、Cytochrome C）有效被降低，說明褪黑素在豬精液常溫保存過程中既發(fā)揮抗氧化作用還發(fā)揮抗凋亡作用。

3）維生素?？梢蕴砑拥截i精液中作為抗氧化劑的維生素主要包括維生素B12、維生素C、維生素E 等。維生素B12本身具有抗氧化性又可以作為一種生物活性物質(zhì)來改善精子周圍的環(huán)境從而提高精子的生存率。與不添加維生素B12的精液相比，當(dāng)在生豬精液中添加45 mmol/L 的維生素B12時可以顯著提高精子的成活率、質(zhì)膜完整性；當(dāng)缺乏維生素B12時精子的DNA 合成與發(fā)育受阻。說明維生素B12作為一種抗氧化劑在一定程度上能夠維持精子正常的生命活動，改善常溫保存中精子的質(zhì)量。維生素C 是一種主要存在于血漿中的水溶性抗氧化劑。當(dāng)在大白豬常溫精液保存劑中添加維生素C 時，精液稀釋劑中的總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽和丙二醛的活性均顯著提高，說明維生素C 能夠提高精子的抗氧化能力，降低精子的凋亡率。維生素E 是帶有過氧化氫自由基清除基團(tuán)的親脂性抗氧化劑。當(dāng)在精液中添加25 mmol/L 的維生素E 時，精子的成活率、質(zhì)膜完整性均顯著提高，顯著降低精子頂體畸形率，并且保存5 d 后的精子在生產(chǎn)中仍可以使用[6]。

4）羧甲基殼聚糖。羧甲基殼聚糖主要通過抑制活性氧（ROS）來降低脂質(zhì)過氧化損傷起到保護(hù)精子的作用。將濃度為70 μg/mL 的羧甲基殼聚糖添加到豬精液稀釋液中，并且在17 ℃的溫度下對稀釋的豬精液保存5 d，發(fā)現(xiàn)精子的活力、線粒體的活性、質(zhì)膜完整率等指標(biāo)均顯著高于未添加羧甲基殼聚糖組，精液pH 值的下降速率減緩并高于未添加組的，且添加羧甲基殼聚糖能夠在一定程度上緩解或者降低非等滲溶液引起的精子膨脹，對精子起到一定的保護(hù)作用[7]。

5）沒食子酸。沒食子酸是一種具有較強(qiáng)抗氧化性的天然酚酸，除了具有抗氧化性還具有抑制大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抗菌能力。趙琦[8]研究發(fā)現(xiàn)將沒食子酸添加到冷凍稀釋劑中，當(dāng)添加劑量為9mg/L 時精子的存活率、A+B 級精子數(shù)、頂體質(zhì)膜的完整性、線粒體膜電位、總抗氧化水平等均顯著提高，且精液中的活性氧、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量均顯著降低，常溫保存10 d 后的精子活率達(dá)62.9%，此研究結(jié)果表明在 稀釋劑中添加沒食子酸能夠延長精液的保存時間、增加抗氧化能力，提高精子的質(zhì)量。

2.5 抑制微生物

在稀釋液中添加一定濃度的抗生素可以有效殺滅精液中的微生物，保證較高的精子活率。除了常見的抗菌劑（磺胺類藥物、恩諾沙星、林可霉素、慶大霉素、青鏈霉素）外，聚維酮碘溶液也可以作為抗菌劑添加至豬精液中，并且可以起到良好的殺菌效果。

3 小結(jié)

雖然豬精液在常溫保存過程中其精子質(zhì)量受到較多因素的影響，但是隨著相關(guān)研究的不斷深入以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，通過添加各種有效成分來調(diào)整稀釋液的成分從而保證精子的質(zhì)量，并延長精液常溫保存的時間?！?/p>