離子液體輔助微波提取紫蘇梗中的黃酮

閆平，王詩媛，張彥，嚴惠仲，同紅娟，柴希艷

1.西安醫學院 （西安 710021）；2.西安風吹麥浪農產品技術開發有限公司 （西安 710065）；3.西安雨潤百德健康管理有限公司 （西安710065）

紫蘇[Perillafrutescens（L.）Britt.]是藥食同源的植物[1-2]。紫蘇葉近年來用以制作咸菜，紫蘇籽用來榨油，而紫蘇梗和花托、殘葉常作為農產品廢棄物被焚燒或還田處理[1-2]。其實紫蘇籽、梗、葉等不同部位均可作為藥材使用[3-5]。紫蘇梗有理氣寬中、止痛、安胎的功效，用于治療胸膈痞悶、胃脘疼痛、噯氣嘔吐、胎動不安[6]。紫蘇籽、梗、葉中均含有黃酮、黃酮苷類化合物[3-5]，近年來紫蘇黃酮的提取研究多集中在紫蘇籽與紫蘇葉上，鮮有紫蘇梗中黃酮的提取與富集的研究[3-6]。

傳統提取黃酮的主要方法是有機溶劑提取，提取效率不高，資源利用度低，溶劑用量大，耗時[7]。離子液體（ionic liquid）是由有機陽離子和無機或有機陰離子組成的熔融鹽，有綠色環保、性質穩定、便于重復利用、萃取率高、可設計性強等特點，可減少萃取分離過程中的環境污染，同時可顯著提高提取率[7-8]。微波輔助提取技術在天然產物的提取中已得到廣泛應用，具有提取率高、溶劑損耗少、時間較短、無醇不溶殘留等特點[9]。試驗運用微波輔助離子液體提取紫蘇梗中黃酮類化合物。將兩者相結合，不但利用離子液體的獨特的性質，而且彌補傳統提取法的不足，達到高效低耗、節約成本的效果。試驗用響應曲面設計確定最佳提取條件。采用HPLC檢測提取的紫蘇梗中相應主成分含量，分析不同方法提取出來的黃酮的主成分的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紫蘇梗為唇形科植物紫蘇[Perillafrutescens（L.）Britt.]除去花葉花托的干燥莖，由楊凌子蘇生物科技有限公司提供，由鄭夢迪和汪興軍共同鑒定。

1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（批號CP061097，蘭州奧力科精細化學品技術有限公司）；六氟磷酸鉀（批號P815654，純度99%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；蘆丁（批號B20771，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；咖啡酸（批號HR15313S1，純度≥98%）、木犀草苷（批號HS09192B1，純度≥98%）、迷迭香酸（批號HR213S01，純度≥98%），均由寶雞晨光生物科技有限公司提供；甲醇（純度≥99.9%，Oceanpak）；甲酸（GC級≥98%，aladdin）；亞硝酸鈉（天津市巴斯夫化工有限公司）；硝酸鋁和氫氧化鈉（沈陽化學試劑廠）；所用水均為蒸餾水。

XH-300A型微波超聲波組合合成萃取儀（北京祥鵠科技發展有限公司）；1220型液相色譜儀（Agilent公司）；SQP型分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；755s型紫外分光光度計（上海棱光技術有限公司）；TDL-40B型醫用離心機（上海安亭科學儀器廠）；RE52型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；1510型全波長酶標儀（昆山市超聲儀器有限公司）；等。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇梗中黃酮的提取1.2.1.1 離子液體提取方法[10]

取2.0 g孔徑0.150 mm（100目）篩的紫蘇梗，加入1 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽離子液體與70%乙醇混合溶液至設定的料液比例，設定微波輸出功率，在規定的溫度下提取至設定時間后，得到粗提液。將5 g六氟磷酸鉀加50 mL蒸餾水完全溶解后室溫放置至沉淀不再增加時過濾即得飽和六氟磷酸鉀溶液[10]。取上粗提液與飽和六氟磷酸鉀溶液，按體積比1∶1混合后靜置4 h，待六氟磷酸鉀與離子液體形成復合鹽沉淀，在3 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液[10]，即得去除離子液體的總黃酮樣品溶液。

1.2.1.2 傳統提取方法

取2.0 g孔徑0.150 mm（100目）篩的紫蘇梗，與70%乙醇混合形成料液比1∶20（g/mL）的混合溶液，在100 ℃下回流提取6 h后得到傳統方法下的樣品溶液[11-12]。

1.2.2 總黃酮的富集

參照文獻方法[13-14]將大孔樹脂D101預處理后，取1.2.1小節的離子液體提取方法中去除離子液體的總黃酮樣品溶液上清液，用70%乙醇稀釋后上樣到大孔樹脂D101的層析柱中，充分吸附，用水洗脫，洗至洗脫液無色并用濃硫酸檢測不出糖，用60%乙醇洗脫至FeCl3檢測呈陰性，分別收集水流出液和醇洗脫液，將醇洗脫液旋蒸至無醇味。

1.2.3 總黃酮含量測定

以蘆丁標準液，參照文獻方法[10,15]，采用AlCl3-NaNO2-NaOH顯色法于510 nm波長處測定吸光度，繪制蘆丁標準曲線。將1.2.2小節富集后得到的提取液用蒸餾水定容100 mL容量瓶中，作為供試品試液。重復以上操作，測定吸光度，根據標準曲線的回歸方程計算黃酮的濃度。

1.2.4 紫蘇梗總黃酮提取單因素考察

以紫蘇梗提取液中的總黃酮提取率為指標，設定70%乙醇與離子液體體積比（簡稱離子液體體積比）分別為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1，微波功率分別為150，350，550，750和950 W，原料粉末與提取液比（簡稱料液比）分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），溫度分別為40，50，60，70和80 ℃，進行單因素試驗，確定適宜條件[10]。

1.2.5 紫蘇梗總黃酮提取響應曲面設計

在單因素試驗基礎上，選取3個對紫蘇梗提取液中總黃酮提取率影響較大的因素，即料液比、離子液體體積比、微波功率。以3個因素為自變量（X），以黃酮提取率為響應值（Y），使用Design-Expert 8.0.6軟件，依據Box-Behnken Design原理進行三因素三水平響應面試驗設計，對提取條件進行優化[10,16]。試驗因素與水平見表1。

表1 紫蘇梗提取響應面因素水平表

1.2.6 高效液相測定

1.2.6.1 色譜條件

參考文獻[5,17]，AgiLent5 HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。流動相為甲醇（B）-0.1%甲酸溶液（A）；波長335 nm。梯度洗脫條件：0～15 min，30%甲醇-0.1%甲酸水70%；15～35 min，51%甲醇-0.1%甲酸水49%；35～65 min，80%甲醇-0.1%甲酸水20%。

1.2.6.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取6.30 mg咖啡酸、2.01 mg木犀草苷、10.6 mg蘆丁、3.92 mg迷迭香酸，加甲醇定容至10 mL，制得不同質量濃度的混合液，搖勻，即得，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.2.6.3 供試品溶液的制備

將制備0.016 mg/mL的紫蘇梗提取液搖勻，使用時過0.45 μm微孔濾膜備用，即得。

1.2.6.4 進樣

取10 μL制備的紫蘇梗提取液，進樣，測定咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積，測定其含量。

1.2.7 方法學考察

1.2.7.1 線性關系考察

精密吸取5，10，12和15 μL 1.2.6小節的混合對照品溶液，進樣，按1.2.6小節的色譜條件進樣分析，以進樣量為橫坐標，含量為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算[5,17]。

1.2.7.2 精密度試驗[5,17]

精密吸取混合對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，計算咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD。

1.2.7.3 穩定性試驗[5,17]

精密吸取10 μL同一批供試品溶液，于0，2，4，8，12，16，24和36 h進樣，按1.2.6小節的色譜條件測定其峰面積，計算得到咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的SRSD。

1.2.7.4 重復性試驗[5,17]

取同一批次供試品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，計算咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

取質量濃度分別為0.008，0.016，0.024，0.032，0.040和0.048 mg/mL的蘆丁標準溶液各200 μL加入到96孔板，用酶標儀測量510 nm波長下的吸光度。以蘆丁標品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，如圖1所示。蘆丁標準曲線方程為Y=3 535.7X，R2=0.997 3。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 紫蘇梗總黃酮提取單因素考察

2.2.1 微波功率

取2.0 g紫蘇梗粉末，離子液體體積比30∶1，料液比1∶20（g/mL），提取溫度50 ℃，反應時間8 min，微波功率分別為150，350，550，750和950 W，考察微波功率對黃酮提取率的影響。按照上述條件所得的提取液中黃酮提取率分別為0.59%，0.62%，0.71%，0.84%和0.75%。

由圖2可知，隨著微波功率的增加，紫蘇梗總黃酮提取率增加，微波功率750 W時黃酮提取率最高，750 W之后提取率反而變低，原因可能是微波功率過大使溫度上升太快，進而使黃酮穩定性降低。對紫蘇梗總黃酮提取的微波功率均選擇750 W。

圖2 微波功率對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.2.2 提取溫度

取2.0 g紫蘇梗粉末，70%乙醇與離子液體體積比20∶1，料液比1∶25（g/mL），微波功率750 W，反應時間8 min，提取溫度分別為40，50，60，70和80 ℃，考察反應溫度對黃酮提取率的影響。按照上述條件所得的黃酮提取率分別為1.19%，1.25%，1.34%，1.35%和1.29%。

由圖3可知，隨著溫度的增加，黃酮提取率增加，70 ℃時黃酮提取率最高，繼續升高溫度，黃酮提取率反而下降，原因可能是溫度太高使黃酮穩定性降低。且由圖3可知，溫度升高對黃酮提取率的影響不大。此后提取溫度均選擇70 ℃。

圖3 提取溫度對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.2.3 料液比

取2.0 g紫蘇梗粉末，離子液體體積比20∶1，反應溫度70 ℃，微波功率750 W，反應時間8 min，料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），考察料液比對黃酮提取率的影響。按照上述條件所得的黃酮提取率分別為0.72%，1.07%，0.78%，0.52%和0.44%。

由圖4可知，料液比達到1∶20（g/mL）時，黃酮提取率最高。液料比繼續增大時，過多的提取劑會使微波能量傳遞減弱，使植物細胞破裂不完全，黃酮無法充分溶解，導致提取率下降。

圖4 料液比對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.2.4 離子液體體積比

取2.0 g紫蘇梗粉末，料液比1∶20（g/mL），微波功率750 W，提取溫度70 ℃，反應時間8 min，70%乙醇與離子液體體積比分別為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1，考察離子液體體積比對黃酮提取率的影響。按此條件所得的黃酮提取率分別為1.01%，1.09%，0.95%，0.72%和0.69%。

由圖5可知，離子液體體積比10∶1時提取率最高，體積比接著增大時離子液體的相對濃度降低，萃取效率降低。

圖5 離子液體體積比對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.3 紫蘇梗總黃酮提取響應曲面設計

按照單因素試驗結果，以黃酮提取率為響應值，設計三因素三水平試驗，根據軟件設計17組試驗方案并完成測定，結果見表2。微波功率（A）、料液比（B）、離子液體體積比（C）與提取率（Y）之間的線性回歸方程為Y=-0.068 280+0.002 131A+1.588 670B+0.011 854C+0.000 286AB+0.000 007AC-0.022 857BC-0.000 002A2-11.561 220B2-0.000 854C2。

表2 紫蘇梗響應曲面試驗方案及結果

由圖6～圖8可知，響應曲面預測的最佳工藝條件為微波功率750 W、料液比1∶28.35（g/mL）、離子液體體積比11.77∶1、溫度70 ℃，在該最佳工藝條件下提取紫蘇梗黃酮的提取率預測值為0.187 206%。

圖6 微波功率、料液比的響應曲面與等高曲線圖

圖7 微波功率、離子液體體積比的響應曲面與等高線圖

圖8 料液比、離子液體體積比的響應曲面與等高線圖

對該模型方程進行方差分析和顯著性檢驗，結果顯示，回歸方程模型F值為45.05，P值小于0.000 1，表明模型顯著，響應面試驗的回歸方程預測紫蘇梗中的黃酮提取率可行。由P值可知，在此試驗范圍內的3個因素對提取率的影響大小順序為微波功率（A）＞離子液體體積比（C）＞料液比（B），因素A、C、A2、B2、C2對提取效果的線性效應均顯著，見表3。

表3 黃酮提取率模型的顯著性檢驗及方差分析

按照響應面預測最佳工藝條件，采取微波功率750 W、料液比1∶30（g/mL）、離子液體體積比12∶1、溫度70 ℃條件進行3次平行試驗，3次平行試驗提取率分別為0.188%，0.176%和0.184%，平均提取率0.183%，與預測值0.187 206%基本吻合，說明響應面設計方案合理。

2.4 HPLC法測定主成分含量

2.4.1 方法學考察結果

2.4.1.1 線性關系

各標準品的回歸曲線、相關系數、線性范圍見表4。

表4 各標準品的回歸曲線、相關系數、線性范圍

2.4.1.2 精密度試驗

咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD分別為3.27%，3.04%，3.36%和4.52%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.3 穩定性試驗

咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的SRSD為0.23%，0.19%，0.41%和0.18%，表明供試品溶液在36 h之內穩定性良好。

2.4.1.4 重復性試驗

咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD分別為0.26%，0.19%，0.49%和0.19%，表明該方法重復性較好。

2.4.2 含量測定

取制備的紫蘇梗樣品，按照1.2.6小節的色譜條件進樣測定的峰面積，運用外標一點法測定其含量，計算得到含量測定結果，見表5。主成分高效液相色譜圖見圖9。

圖9 主成分高效液相色譜圖

表5 紫蘇梗部分主成分含量測定 單位：mg/g

由表5可知，離子液體輔助微波提取的黃酮中木犀草苷和蘆丁比傳統方法含量均高，說明該方法切實可行。此外，《藥典》中規定的紫蘇梗的指標性成分迷迭香酸的含量也高于傳統方法[18]。

3 結論與討論

使用響應面設計優化提取工藝，該模型應用隨機過程的統計學試驗方法，同時采用微波提取作為提取手段，有提取溶劑用量少、時間較短、節能環保等特點[19]，離子液體為輔助提取溶劑，具有提取率高、溶劑損耗少的特點[20]。新方法即離子液體輔助微波提取比傳統方法總黃酮主成分提取率高。最佳工藝為微波功率750 W，料液比1∶30（g/mL），離子液體體積比12∶1，溫度70 ℃，在該最佳工藝下提取紫蘇梗黃酮的提取率預測值為0.187 206%。經試驗驗證黃酮平均提取率為0.183%，與預測值接近，說明響應面設計方案合理。按照新方法提取得到的紫蘇提取物中紫蘇中具有抗氧化、抗腫瘤等活性的黃酮成分木犀草苷和蘆丁含量均高于傳統方法，且酚酸類主成分迷迭香酸和咖啡酸也高于傳統方法[21-22]。因此，試驗所優化的最佳提取方案可行，將微波輔助離子液體運用于紫蘇梗黃酮提取的方法可行。

提取黃酮類化合物采用的離子液體主要是烷基咪唑鹽類，其中以1-丁基-3-甲基咪唑鹽類居多。蘇適等[24-25]以1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽離子液體為提取劑，采用超聲波輔助提取黑豆異黃酮；微波輔助離子液體提取黑豆皮花青素，且提取率均大于傳統方法。潘思源等[26]進行了微波輔助離子液體提取法與傳統提取方法對羅布麻葉總黃酮的提取研究，結果表明微波離子液體法比微波乙醇法和乙醇熱回流法所得的總黃酮提取量均高。

試驗具有一定創新性。離子液體作為一種綠色環保溶劑，減少能耗，有助于植物黃酮的提取[19]。試驗使用的咪唑類離子液體可作為提取劑用于植物中多種活性物質如生物堿類、黃酮類、果膠、色素、植物內酯等的提取[20]。試驗具有一定的應用價值。紫蘇梗作為農產品廢棄物被丟棄或焚燒，紫蘇梗富含木質纖維素和高附加值天然活性物質，現處置方式多為焚燒或直接還田，造成紫蘇梗中天然活性物質喪失[23]，既污染環境又造成浪費。試驗實現從紫蘇梗中提取與富集黃酮，為高效環保開發利用這種生物活性成分提供切實可行的解決方案，填補國內空白，可實現農副產品的綜合利用。采用新型綠色的有機溶劑離子液體提取，為農產品廢棄物中活性成分的提取與后期的綜合利用與開發提供新思路。

試驗仍存在不足，未完全闡明離子液體提取黃酮的具體原理。猜測可能與化合物的極性和離子液體的結合方式有關，也可能與化合物中酚羥基含量有關，還可與離子液體黏度及傳質效果有關，溴離子與被提取物之間可能產生多重相互作用[10]。紫蘇梗中富含纖維素[23]，后期可加上生物酶解的步驟，先分解其中的纖維素，可能更能提高紫蘇黃酮的提取率。另外，紫蘇中黃酮苷類主要以野黃芩素、木犀草素、芹菜素為母核的單糖及二糖葡萄糖醛酸苷類成分為主[21-22]，該類成分的高效提取有待后續深入研究。