微波輔助提取釀酒葡萄皮渣花色苷及抗氧化性研究

劉志偉，呂淑娟，趙琳，張媛雯，李慶亮，譚偉*

1.棗莊學院食品科學與制藥工程學院/山東省石榴精深加工工程技術研究中心 （棗莊 277160）；2.棗莊學院生命科學學院 （棗莊277160）

葡萄自絲綢之路傳入中原后便被廣泛應用推廣，陜西、山東等地是葡萄的主要產區[1-2]。經多年發展，我國在世界葡萄酒消費市場占主要地位，葡萄酒行業在2020年全國營業收入達100.21億[3-4]。葡萄釀酒產業的蓬勃發展使得葡萄釀酒副產物葡萄皮渣的產量不斷上升。葡萄皮渣內富含白藜蘆醇、單寧、天然色素、黃酮、多酚等功能性物質，但大部分的葡萄皮渣多被用作肥料或飼料，其利用率極低且會對環境造成一定的污染[5-7]。目前已有研究人員將葡萄皮渣內活性成分添加到食品領域，以提高產品的感官與營養價值[8-11]。

花色苷屬于花色素類物質，對葡萄酒顏色起關鍵作用，是一類天然存在于植物中的水溶性色素[12]，其綠色無毒，安全性高，具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗癌等藥理作用[13-15]。因此對釀酒葡萄皮渣綜合應用的研究可提高葡萄皮渣利用率，延長食品產業鏈，降低對環境的不良影響。目前關于花色苷常用的提取方法有浸提法、酶解提取法、超高壓提取法等[16]。Liu等[17]通過變功率微波輔助提取法，在最優條件下得到84.82%的藍莓花色苷萃取率。許丹妮等[18]采用雙水相法提取葡萄皮渣花色苷的最佳工藝需要在酸性條件下使用乙醇和硫酸銨液體，但試劑污染可能性較大。黃茜等[19]提取葡萄皮花色苷選用了內部沸騰法，所得最佳工藝需在85 ℃下提取5 min，所用時間短，但過高的溫度不利于花色苷結構穩定。郝俊光等[20]試驗發現在真空度0.08 MPa下提取120 min才能達到毛葡萄皮渣花色苷提取的最優工藝，但試驗時間過長，不適用于工廠加工和推廣。

經文獻[17-20]比較，采用“西拉”葡萄皮渣為原料，檸檬酸為提取劑，利用微波進行輔助處理，通過單因素試驗與正交試驗，篩選出釀酒葡萄皮渣花色苷的最佳提取工藝；分析其對DPPH與ABTS+的清除能力，為葡萄釀酒葡萄皮廢渣的綜合利用提供科學依據，為其進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“西拉”釀酒葡萄皮渣由山東君頂酒莊有限公司提供，烘干后，去籽留用；檸檬酸（國藥試劑有限公司）。

XH 200A型祥鵠電腦微波固液相合成/萃取儀（北京祥鵠科技發展有限公司）；PHS-2F數字pH計（上海澳司豪儀器有限公司）；UV-2600 紫外分光光度計（日本島津公司）；CPA224S萬分之一電子天平（德國塞多利斯公司）。

1.2 花色苷提取與含量計算

將干燥后的葡萄皮進行粉碎，準確稱取1.000 g葡萄皮粉末于試管中，按照不同的料液比加入檸檬酸溶液，在一定微波功率下提取一定時間后，得到花色苷提取液。

將1.0 mL提取液分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液定容至10 mL，暗處理2 h后，用紫外分光光度計測定其在700 nm和520 nm波長處的吸光度，選用pH示差法測定計算總花色苷含量[21]。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同檸檬酸濃度條件下花色苷提取

檸檬酸濃度分別設置為1.5%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%，設置微波功率450 W、微波時間20 min、溫度45 ℃、料液比1∶25（g/mL），根據提取的總花色苷含量選擇出最佳檸檬酸濃度。

1.3.2 不同料液比條件下花色苷提取

料液比分別設置為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35（g/mL），設置微波功率450 W、微波時間20 min、檸檬酸濃度2.5%，根據提取的總花色苷含量選擇出最佳料液比。

1.3.3 不同微波功率下花色苷提取

電氣設備的質量問題首先體現在安裝方面，因為安裝過程中的動、靜觸頭無法實現完全的接觸，或者是接觸面積達不到安全性的需要，也可能是因為動力不足，也容易存在很多的安裝操作失誤的情況，從而導致了接觸面積存在嚴重的電熱氧化問題，在具體的應用過程中電阻增大，使得觸頭出現了強擊電流，造成了觸頭出現了損傷的情況，使用壽命也無法滿足使用的需要。其次，斷路器中的弧觸安裝中存在很多的問題，比如接觸力度不足等問題，使得在正常工作的過程中觸頭結構的溫度持續的上升，使得溫度過高而存在絕緣介質的分化，壓力會急劇的提升，一旦操作不當就會出現因為溫度超高而出現爆炸的危害，極易造成工程安全性無法滿足要求[2]。

微波功率分別設置為350，450，550，650和750 W，設置料液比1∶25（g/mL）、微波時間20 min、檸檬酸濃度2.5%，根據提取的總花色苷含量選擇出最佳微波功率。

1.3.4 不同微波時間下花色苷提取

微波時間分別設置為10，20，30，40和50 min，設置微波功率450 W、料液比1∶25（g/mL）、檸檬酸濃度2.5%，根據提取的總花色苷含量選擇出最佳微波時間。

1.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用四因素三水平研究檸檬酸濃度、料液比、微波功率、微波時間四個因素對釀酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影響，以此達到優化其提取工藝的目的。

1.5 DPPH自由基清除的能力測定

參照張澤生等[22]的方法略作修改。將質量濃度分別為0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mg/mL的葡萄皮渣花色苷提取液，分別與25 mg/L甲醇溶液混合均勻，黑暗反應20 min后在515 nm波長處測定吸光度A1；用無水乙醇代替葡萄皮渣花色苷提取液，按照同樣的方法，測定吸光度A0，重復測定3次。DPPH自由基清除率=

1.6 ABTS+·清除能力的測定

根據王月等[23]的方法略作修改。將7.4 mmol/L ABTS+·溶液與2.6 mmol/L K2S2O8溶液混合，室溫暗處理12 h后用無水乙醇將混合液稀釋。將不同濃度的葡萄皮渣花色苷提取液與ABTS+工作液搖勻混合，室溫靜置6 min，在734 nm波長處測定吸光度A1。用無水乙醇代替葡萄皮渣提取液，同樣操作，測定吸光度A2，重復測定3次。ABTS+·清除率

1.7 數據處理與統計分析

數據處理采用Excel 2013，每個數據為3次重復測量數據的均值和標準差。用SPSS 16.0數據分析軟件在P≤0.05水平下進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 檸檬酸濃度對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

圖1 不同檸檬酸濃度對釀酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影響

2.1.2 料液比對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

如圖2所示，提取所得總花色苷含量隨料液比的減小呈先上升后降低趨勢。當料液比達到1∶25（g/mL）時，提取的總花色苷含量達到最高，提取量為2.238 mg/g；料液比為1∶15（g/mL）提取的總花色苷含量最低。因此，選擇最佳料液比1∶25（g/mL）及兩邊的1∶20（g/mL），1∶30（g/mL）作為正交試驗料液比的3個水平。

圖2 不同料液比對釀酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影響

2.1.3 微波功率對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

如圖3所示，總花色苷提取量隨微波功率的提高，總體上呈逐步上升趨勢。當微波功率為750 W時，花色苷提取量達到最高，為3.313 mg/g。因此，考慮到功率與電量的關系，選擇750，650和550 W作為正交試驗微波功率的3個水平。

注：不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著（P＜0.05）。

2.1.4 微波時間對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

如圖4所示，總花色苷含量隨微波時間的延長呈先上升后下降的趨勢，含量在3.375～4.323 mg/g之間。微波時間40 min時，總花色苷含量最高，比30 min時高6.83%。因此，去掉總花色苷含量最低的兩個水平，選擇最佳微波時間40 min及30 min，20 min作為正交試驗微波時間的3個水平。

注：不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 正交試驗結果及分析

經上述單因素試驗分析，選擇各因素的三水平按照L9(34)進行正交試驗，正交試驗表如表1所示。

表1 釀酒葡萄皮花色苷提取正交因素水平設計表

通過正交試驗對釀酒葡萄皮查花色苷的提取條件的分析，結果表明，影響釀酒葡萄皮總花色苷含量提取的四個因素影響主次順序為料液比＞檸檬酸濃度＞微波功率＞微波時間（見表2）。最佳提取工藝為料液比1∶30（g/mL）、2.50%的檸檬酸濃度、微波功率750 W、微波時間40 min。在此條件下做3次重復試驗，所得總花色苷含量最高，為4.461 mg/g。

表2 花色苷提取正交試驗分析表

2.3 釀酒葡萄皮花色苷對DPPH自由基和ABTS+·自由基的清除能力

從圖5可以看出，釀酒葡萄皮渣花色苷對DPPH自由基和ABTS+自由基均具有較強的清除能力，且隨質量濃度的逐步提高，清除能力逐漸增強。當釀酒葡萄皮渣花色苷的質量濃度達到2.0 mg/mL時，其對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分別可達76.20%和96.82%。

圖5 葡萄皮渣花色苷對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力

3 討論及結論

葡萄皮渣作為葡萄副產品是一種可添加的生活功能性食品成分，其內富含的花色苷具有著色功能，可視為人工合成添加劑的綠色替代品[24]。目前關于花色苷最常用的提取方法有溶劑浸提法、超聲輔助法、微波輔助提取法、加壓液體提取法等。黃瑜等[25]使用雙水相法提取葡萄皮渣中花色苷，在最優條件（乙醇質量分數為28.00%，硫酸銨質量分數為18.14%，pH 3.00，料液比為1∶35 g/mL）下花色苷得率為4.430 mg/g。張巖等[26]利用單因素試驗和響應面法優化了超聲提取葡萄皮渣花色苷的工藝，以2.50%的磷酸為提取劑，在料液比1∶25 g/mL，超聲功率300 W，50 ℃下超聲25 min，提取的花色苷含量為4.034 mg/g。文章主要研究微波輔助檸檬酸提取釀酒葡萄皮渣花色苷，通過單因素試驗與正交試驗優化了微波提取釀酒葡萄皮渣花色苷工藝的優化。最優條件：2.50%的檸檬酸為提取劑，在50 ℃下微波40 min，微波功率為750 W，選用1∶30（g/mL）的料液比，在此條件下，平行試驗3次，提取的花色苷含量為4.461 mg/g，提取率可達4.461‰，高于前人研究。提取的花色苷對DPPH和ABTS+·自由基的清除能力較高，表明其具有較強的抗氧化能力。

綜上：試驗采用檸檬酸為提取液，在提高花色苷萃取率的同時降低試劑污染，不僅提取物的安全性得到提高，對自由基的清除能力也有所增強，為花色苷進一步應用于食品、保健、醫療等領域提供可行性的理論依據；試驗過程中采用的溫度適中，利于花色苷的結構穩定；微波工藝用時短、效率高、工藝簡單，大大降低了試驗時間與能耗，可在大規模生產的工廠中進行推廣。