高產海藻糖菌株的選育及轉化條件優化

周培華，張海韻，劉蘭，鐘文濤，廖燕芝，袁列江

湖南省產商品質量檢驗研究院，食品安全監測與預警湖南省重點實驗室 （長沙410017）

海藻糖是由2個葡萄糖通過α-α-1-1糖苷鍵組成的雙糖，它具有很多優異的化學性質和獨特的生物活性[1-3]，尤其在一些極端環境中，它能夠在生物細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護生物分子結構不被破壞，從而維持生命體的生命過程和生物特征[4-7]。其因為獨特的性能，在醫療、食品、藥品、生化、分子生物學領域起著至關重要的作用，在相關行業有著“生命之糖”的美稱[8-11]。海藻糖和麥芽糖的分子結構如圖1所示。

目前海藻糖的生產主要通過化學合成和海藻糖相關酶系轉化生產[12]，但是海藻糖生產相關的核心酶制劑大量依賴國外進口，國內為了打破該領域的技術壟斷做了一系列的嘗試，取得了一些成果，其中以微生物發酵最具發展潛力，但是據報道，目前海藻糖的生產菌株仍然存在底物轉化率低，生產及后續提取繁瑣等問題[13-15]。國內微生物發酵法的核心問題在用于海藻糖生產的微生物菌株生產效率太低，研究以一株能夠轉化麥芽糖生成海藻糖的耐熱芽孢桿菌為出發菌株，通過γ-Co60誘變構建突變菌株庫，通過自主建立海藻糖高產優質菌株篩選模型定向選育能夠低成本、高效率轉化麥芽糖生成海藻糖的優質菌株，并對突變菌株產業化潛力進行多方面考察，以期實現海藻糖生產領域的技術自主化。

1 材料與試劑

1.1 菌株

實驗室從自然界溫泉附近篩選得到的能轉化麥芽糖生成海藻糖的耐熱芽孢桿菌HS-202006211109-117，6 h可轉化20 mg/mL麥芽糖（W/W）生成濃度為3.73 mg/mL海藻糖。

1.2 初篩平板培養基

(NH4)2SO40.5%，麥芽糖5%，NaCl 10%，丙酸0.01%，MgSO40.001%，ZnSO40.001%，瓊脂3.5%，0.1%磷酸，調pH至3.0。

1.3 檢測試劑

乙腈（色譜純），一水合麥芽糖（純度100.0%，安譜），海藻糖（分析純99%，上海麥克林生化科技有限公司），麥芽糖（純度95%，國藥集團），嗜滲酵母 CICC32788，DG18瓊脂培養基（北京陸橋），營養瓊脂，腦心肉湯（BHI）（北京陸橋）。

1.4 試驗耗材

氨基柱（sigma），10 mL EP管、無菌培養皿、100～1 000 μL移液槍，1～10 mL移液槍（艾本德）。

1.5 儀器與設備

AR423DCN電子天平（美國ohaus澳豪斯）；MIR-254培養箱（Panasonic松下電器產業株式會社）；LC-20A高效液相色譜儀（日本shimadzu島津公司），J157數顯折光儀（美國魯道夫公司）；TG16-WS離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋（日本平山Hirayama）。

2 方法

2.1 篩選方法

出發菌株γ-Co60誘變構建突變菌株庫，涂布至1.2小節平板初篩培養基，具有轉化麥芽糖生成海藻糖潛力的突變菌株能夠在該培養基上生長。挑取生長旺盛的單菌落接種至20 mg/mL麥芽糖溶液中，轉化若干時間，利用海藻糖不能被酵母發酵的生物特性，加入此次試驗自主選育的優良嗜滲酵母快速消耗麥芽糖，再使用折光儀檢測殘糖濃度[16]，如果該菌株具備高效轉化麥芽糖生成海藻糖能力，則折光儀測得值會較高，因此能高效轉化麥芽糖生成海藻糖的目的突變株會在該環節脫穎而出，最后通過高效液相色譜（HPLC）法定性定量檢測該菌株的海藻糖生產量。

2.2 突變菌株庫構建

2.2.1 出發菌株菌懸液

耐熱芽孢桿菌HS-202006211109-117劃線接種至營養瓊脂培養基中，出發菌株45 ℃培養2 d后，用無菌生理鹽水10 mL刮洗，加入無菌生理鹽水調至麥氏濁度2.0左右，搖勻分裝在2 mL離心管備用。

2.2.2γ-Co60誘變致死試驗，致死曲線繪制，突變菌株庫構建

取8管分裝好的出發菌株管，設置8個輻照梯度（300，600，900，1 200，1 500，1 800，2 100和2 400 Gy）進行輻照誘變。

將未照射菌液和不同輻照劑量誘變菌液各取1 mL加入9 mL無菌生理鹽水，逐級稀釋至105，吸取0.1 mL涂布至營養瓊脂平板上，每管涂10個NA平皿，計算輻照誘變的致死率，輻照誘變致死率=（X0-Xn）/X0×100%，見表1。選取致死率在90%左右的輻照劑量對各出發菌株菌懸液管進行輻照，獲得突變菌株庫，用于后續篩選。

表1 出發菌株γ-Co60輻照誘變致死曲線表

2.2.3 嗜滲酵母折光儀聯用檢測非發酵糖

通過配制嗜滲酵母CICC32788菌懸液和制作海藻糖、麥芽糖的混合標準曲線，經過嗜滲酵母消耗發酵性糖后，利用數顯折光儀進行標準曲線的制作和篩選菌株的轉化產物的測定，篩選出轉化生成海藻糖高的突變菌株。

2.2.4 HPLC檢測海藻糖含量

分別精密稱取約1 g恒重的海藻糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖定容到10 mL，各標準物質的單標質量濃度為100 mg/mL，分別取1 mL定容到10 mL，得10 mg/mL單標；分別各取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和2.0 mL的100 mg/mL的母液10 mL定容，得到質量濃度分別為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和20.0 mg/mL的混合標準曲線。

HPLC色譜條件：色譜柱，氨基柱，柱溫30 ℃；檢測器，示差檢測器；流動相配比，乙腈80%純水20%，流速1.0 mL/min。

挑取2.2.3小節中檢測值較高的突變菌株，接種至20.0 mg/mL麥芽糖溶液，在45 ℃培養箱發酵轉化6 h后，于100 ℃水浴滅活。吸取適量經過0.22 μm濾膜后裝入液相色譜小瓶，HPLC上機檢測。

2.3 突變菌株遺傳穩定性

將篩選鑒定的突變菌株劃線接種至營養瓊脂NA平板，獲得純化的單菌落，挑取生長優異的單菌落接種至營養瓊脂斜面，一環劃線接種至營養瓊脂斜面于45 ℃培養36 h，而后4 ℃冰箱冷藏保存，另一環劃線接種至另一營養瓊脂NA平板，于45 ℃培養36 h，以此操作進行傳代接種15代。培養結束后，按2.2.4小節HPLC方法檢測每一代的轉化麥芽糖生成海藻糖的能力，考察突變菌株遺傳穩定性。

2.4 轉化底物耐受度考察

選取遺傳穩定性較好、海藻糖轉化能力較強的F-2119，培養制作菌懸液，分別接種至20，25，30，35和40 mg/mL濃度麥芽糖溶液中，于45 ℃轉化6 h，按2.2.3小節方法檢測生成的海藻糖含量。

2.5 突變株對于轉化溫度的考察

選取遺傳穩定性較好、海藻糖轉化能力較強的F-2119，培養制作菌懸液，用無菌生理鹽水調節麥氏濁度1.5，分別接種至20 mg/mL麥芽糖溶液中，分別于35，40，45，50，55和60 ℃轉化6 h，按2.2.3小節方法檢測生成的海藻糖含量。

3 結果與分析

3.1 致死曲線繪制，γ-Co60輻照劑量確立

出發菌株輻照誘變至死曲線繪制如圖2所示。隨著輻照強度的增加，致死率一直上升，直到劑量為2 100 Gy時，致死率達到99.53%。

圖2 出發菌株HS-202006211109-117 γ-Co60輻照致死曲線

圖3 突變菌株測定結果

3.2 突變菌株測定結果

通過對HS-202006211109-117和突變株的嗜滲酵母折光儀聯用檢測海藻糖含量，結果顯示在正突變株中F-2119、H-5213和C-3017的轉化產海藻糖量顯著高于其他突變株。此3個正向突變株轉化產物稀釋后再經過HPLC進行驗證測定，結果顯示，測定結果同初篩結果一致。

3.3 突變株遺傳穩定性實驗結果

突變菌株C-3017、F-2119、H-5213分別經過15次傳代培養，每代的轉化生成海藻糖的結果如圖4所示。轉化率和穩定性各菌株顯示各自的特征，其中F-2119轉化率和穩定性最優。

圖4 突變株C-3017、F-2119、H-5213轉化生成海藻糖的遺傳穩定性考察

3.4 突變株轉化底物濃度耐受度實驗結果

F-2119的轉化不同濃度麥芽糖生成海藻糖的能力如圖5所示。隨著底物濃度的升高，轉化率呈下降趨勢，考慮得率與轉化率，底物濃度選擇25 mg/mL。

圖5 突變株F-2119轉化不同濃度底物麥芽糖生成海藻糖的能力考察

3.5 突變株轉化溫度耐受度實驗結果

F-2119不同溫度下轉化麥芽糖生成海藻糖的能力如圖6所示。隨著溫度的升高，轉化率呈上升趨勢，升到一定溫度后，轉化率又會下降，故轉化溫度選擇55 ℃。

圖6 突變株F-2119不同溫度轉化麥芽糖生成海藻糖的能力考察

圖7 轉化條件優化前后突變株轉化生成海藻糖的能力考察

3.6 轉化條件優化后突變株轉化生成海藻糖試驗結果

通過比較初始轉化條件底物濃度20 mg/mL、轉化溫度45 ℃與優化后轉化條件底物濃度25 mg/mL、轉化溫度55 ℃，產物海藻糖濃度由14.30 mg/mL提高到16.46 mg/mL。

4 結論與討論

在傳統海藻糖高產菌株選育的工作中，傳統檢測海藻糖的方法一般有三氯乙酸提取法結合硫酸蒽酮法、海藻糖酶降解法結合硫酸蒽酮法、液相色譜法[17-18]。以上3種方法檢測過程極其繁瑣，檢測成本非常高，無法將其應用于針對數萬突變菌株篩選的檢測，對此文章使用自建選育模型和高效篩選方法，通過自己的設計、研究和實驗，構建了釀酒酵母差量消耗聯用折光儀法，大量排除不產海藻糖或低產海藻糖的突變菌株，從而實現了該篩選模型的高通量性，最后將篩選獲得的突變菌株結合高效液相色譜進行定性定量確認。利用此篩選模型，從自然界中獲得能夠轉化麥芽糖生產海藻糖的菌株——耐熱芽孢桿菌HS-202006211109-117，6 h轉化麥芽糖生成海藻糖量為3.73 mg/mL，以此為出發菌株，通過誘變及選育模型的篩選得到3株具有海藻糖生產潛力的C-1037，F-2119和H-5123，6 h轉化麥芽糖生成海藻糖量C-1037（12.31 mg/mL）、F-2119（14.30 mg/mL）、H-5123（16.61 mg/mL），較出發菌株分別提高到3.30，3.83和4.45倍，通過遺傳穩定性實驗確定F-2119遺傳穩定性最好，最具有產業化潛力。隨后對突變菌株F-2119的轉化底物濃度耐受性和轉化溫度耐受性進行試驗考察，得出麥芽糖底物濃度為25 mg/mL，轉化溫度為55 ℃時，轉化效率較初始條件提高15.1%，較高濃度底物和較高轉化溫度可以減少在規?；a的過程中的雜菌污染。

綜上所述，文章建立的海藻糖高產菌株選育模型是一種通量高、篩選壓力足、準確性很好的菌株定向選育模型，可以在短時間內在數以萬計的突變株中快速篩選獲得海藻糖產量高且性能優異的突變菌株，該選育模型對微生物法生產海藻糖將起到極大的推動作用。