金屬離子對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

馬雙雙，張英華，張杰，李珍愛(ài)，李艷艷，李海軍,2,3*

1.山東福瑞達(dá)生物科技有限公司 （臨沂 276715）；2.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 （濟(jì)南 250098）；3.山東省藥學(xué)科學(xué)院 （濟(jì)南250098）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一種由微生物合成、以谷氨酸為唯一單體的共聚高分子聚合物，其特點(diǎn)是溶液黏度高，具有高度的水溶性、保濕性、生物相容性、生物可降解性等優(yōu)良特性，在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[1-6]。但高黏度的特點(diǎn)同時(shí)也限制了發(fā)酵過(guò)程中傳質(zhì)和傳氧，導(dǎo)致γ-PGA發(fā)酵產(chǎn)量低，限制γ-PGA的推廣應(yīng)用[7-8]。針對(duì)上述問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展大量研究工作，包括高產(chǎn)菌種篩選及改造、培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝優(yōu)化等，以期提高γ-PGA發(fā)酵產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本[9-14]。

金屬離子在微生物培養(yǎng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，它們不僅可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物的合成，而且可以調(diào)節(jié)酶的活性，保護(hù)生物體的基本組織及細(xì)胞的完整性，調(diào)整細(xì)胞的滲透壓以及控制細(xì)胞的氧化還原電位等[15]，如：鈉可維持細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓平衡；鉀參與細(xì)胞運(yùn)輸系統(tǒng)的組成；鈣調(diào)節(jié)質(zhì)膜的通透性；鎂能促進(jìn)碳源的分解，加速菌體能量代謝；鋅、鐵、錳、銅等可作為酶的輔助因子，參與微生物代謝過(guò)程中的氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)[16-19]。因此，對(duì)培養(yǎng)基添加金屬離子對(duì)自行選育的枯草芽孢桿菌FRD215產(chǎn)γ-PGA的影響情況進(jìn)行研究，以期通過(guò)在培養(yǎng)基添加金屬離子提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）FRD215，實(shí)驗(yàn)室自行選育和保藏的菌種。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，谷氨酸鈉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，K2HPO42 g/L，pH 7.3～7.5，115 ℃，30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖120 g/L（單獨(dú)滅菌）、蛋白胨10 g/L、谷氨酸鈉70 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L，K2HPO42 g/L、(NH4)2SO415 g/L，pH 7.3～7.5，121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平、FE20 pH計(jì)[梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司]；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；ZHJH-C1115B垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）；ZHWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；3-18臺(tái)式高速離心機(jī)（上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司）；1200 Series高效液相色譜儀（Agilent Technologies）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

菌種培養(yǎng)：取菌種凍存管，菌種解凍后，取100 μL接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在37 ℃，250 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的菌懸液按5%的轉(zhuǎn)種量，接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在37 ℃，250 r/min條件下培養(yǎng)72 h。

1.3.2 試驗(yàn)方法

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

在原發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加不同濃度Na+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+，其他發(fā)酵條件不變，具體添加量按照表1所示，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)濃度梯度。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)分析，采用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化金屬離子添加量，每組試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行，以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。

1.3.3γ-PGA含量檢測(cè)方法

采用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）測(cè)定γ-PGA含量。

色譜條件：Waters Uittrahydrogel 100[7.8 mm× 3 0 0 mm（內(nèi)徑）]色譜柱；流動(dòng)相為10 mmol/L NaH2PO4·12H2O和15 mmol/L KH2PO4緩沖液，用0.22 μm的膜過(guò)濾器過(guò)濾；柱溫30 ℃；流動(dòng)相流速0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品曲線制作：取約0.1 g標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.000 1 g；溶于20 mL純化水中，攪拌1 h后，移至100 mL容量瓶中定容，配制成1 g/L母液，取適量母液逐級(jí)稀釋，配制0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g/L的質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液；經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。利用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，建立峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的配制：取約2.0 g樣品，精確至0.000 1 g；溶于20 mL蒸餾水中，攪拌1 h后，移至100 mL容量瓶中定容，按12 000 r/min處理5 min；上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.3和SSPSAU軟件處理和分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

鈉與維持細(xì)胞滲透壓有關(guān)，是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的必要成分。試驗(yàn)在原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NaCl，探究Na+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響，結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比，添加量0.1～6.4 g/L對(duì)γ-PGA發(fā)酵產(chǎn)量無(wú)明顯影響，添加量25.6 g/L時(shí)，PGA發(fā)酵產(chǎn)量降低29.4%。培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)腘a+水平可保證細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)菌體的正常繁殖及代謝。如果Na+水平超出正常范圍，就可能引起細(xì)胞的質(zhì)壁分離，導(dǎo)致菌體活性降低，進(jìn)而影響目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明培養(yǎng)基中Na+含量已足夠維持枯草芽孢桿菌生產(chǎn)代謝需求。

2.2 Ca2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

鈣存在于細(xì)胞中，控制細(xì)胞的生理狀態(tài)，調(diào)節(jié)質(zhì)膜的通透性，維持細(xì)胞體內(nèi)的滲透壓，同時(shí)鈣離子還是許多酶的活性因子[16]。試驗(yàn)在原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加CaCl2，探究Ca2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響，結(jié)果如圖2所示。0.1～0.8 g/L的Ca2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA有促進(jìn)作用。與對(duì)照相比，隨著CaCl2添加量的增加，γ-PGA產(chǎn)量逐漸增加，且添加量0.8 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到最高，比對(duì)照組提高25.2%。添加量1.6 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量較對(duì)照組下降30.6%。這可能是由于過(guò)量的Ca2+與培養(yǎng)基中的磷酸鹽、硫酸鹽發(fā)生反應(yīng)生成沉淀，導(dǎo)致培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素缺失，進(jìn)而導(dǎo)致γ-PGA產(chǎn)量下降。

2.3 Mn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

錳可以顯著提升丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶等酶的活性，對(duì)芽孢桿菌芽孢的生成具有促進(jìn)作用[15]。試驗(yàn)在原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加MnSO4·H2O，探究Mn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響，結(jié)果如圖3所示。0.1～0.8 g/L的Mn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA有促進(jìn)作用，但沒(méi)有明顯的濃度梯度效應(yīng)。0.1 g/L和0.8 g/L的添加量γ-PGA的產(chǎn)量分別提高15.5%和16.4%。添加量1.6 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量有所下降。這一結(jié)果與添加Ca2+的試驗(yàn)結(jié)果類似，過(guò)量的Mn2+與培養(yǎng)基中的磷酸鹽發(fā)生反應(yīng)生成沉淀，導(dǎo)致培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素缺失，進(jìn)而影響γ-PGA產(chǎn)量。

圖3 Mn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響

2.4 Fe3+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

鐵是菌體的細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化物酶的組成元素，是菌體生命活動(dòng)必需的元素之一。試驗(yàn)在原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加FeCl3·7H2O，探究Fe3+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響，結(jié)果如圖4所示。添加量0.02和0.04 g/L對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA有促進(jìn)作用，γ-PGA產(chǎn)量較對(duì)照組分別提高12.1%和9.8%。0.08 g/L及以上添加量對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA有抑制作用，F(xiàn)eCl3·7H2O添加量0.32 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量較對(duì)照組下降35.1%。

圖4 Fe3+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響

2.5 Cu2+、Zn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

鋅、銅可作為酶的輔助因子，參與微生物代謝過(guò)程中的氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)[21-22]。試驗(yàn)在原發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加CuSO4·5H2O和ZnSO4，探究Cu2+和Zn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響，結(jié)果如圖5和圖6所示。0.01～0.08 g/L濃度范圍內(nèi)，Cu2+和Zn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA無(wú)明顯影響。添加量0.16 g/L時(shí)，其對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA有抑制作用，γ-PGA產(chǎn)量分別降低17.8%和13.6%。

圖5 Cu2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

圖6 Zn2+對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響

2.6 正交試驗(yàn)確定金屬離子的最佳添加量

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA有正影響的金屬離子分別是Ca2+、Mn2+、Fe3+。基于單因素試驗(yàn)，將CaCl2添加量（A）、MnSO4·H2O添加量（B）和FeCl3·7H2O添加量（C）作為研究對(duì)象，并以γ-PGA產(chǎn)量作為指標(biāo)，采用L9(33)的正交試驗(yàn)表，詳細(xì)分析各個(gè)因素的影響。正交試驗(yàn)因素水平如表2所示。結(jié)果與分析，如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)因素水平 單位：%

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

從正交試驗(yàn)結(jié)果可知：影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的因素順序?yàn)锳＞C＞B，即CaCl2添加量＞FeCl3·7H2O添加量＞MnSO4·H2O添加量；最優(yōu)組合為A2B2C2，即在原發(fā)酵培養(yǎng)基中同時(shí)添加CaCl20.8 g/L、FeCl3·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L。在此條件下，γ-PGA產(chǎn)量達(dá)53.34 g/L，比原發(fā)酵培養(yǎng)基至少提高40.0%以上。

3 結(jié)論

近來(lái)國(guó)內(nèi)外主要選用芽孢桿菌屬為代表，研究微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA。培養(yǎng)基作為微生物發(fā)酵法中關(guān)鍵的一部分，對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝影響巨大。而金屬離子作為培養(yǎng)基中的重要成分，參與細(xì)胞中多種生化反應(yīng)，是微生物正常代謝必不可少的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[19-21]。探究6種金屬離子對(duì)枯草芽孢桿菌FRD215發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的影響，單因素結(jié)果表明：不同種類、不同濃度的金屬離子對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的影響差別較大。其中：在培養(yǎng)基中添加一定量的鈣、錳、鐵離子可促進(jìn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA，而添加鈉、銅、鋅離子對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA無(wú)明顯影響。通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定培養(yǎng)基中鈣、錳、鐵離子的添加量，分別為CaCl20.8 g/L、FeCl3·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L，在此條件下，γ-PGA產(chǎn)量達(dá)53.34 g/L，比優(yōu)化前至少提高40.0%以上。后續(xù)將繼續(xù)進(jìn)行小試和大試放大試驗(yàn)。

結(jié)果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的金屬離子鈣、錳、鐵可提高γ-PGA產(chǎn)量，該結(jié)果對(duì)枯草芽孢桿菌FRD215大規(guī)模應(yīng)用和γ-PGA大規(guī)模生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。