柳葉蠟梅醇提物酚類成分及其抗氧化活性研究

何紀元，鄧柳鴻，李欣悅，高逸萱，劉盛榮，魏奇

1.寧德師范學院生命科學學院 （寧德 352100）；2.福建省科技廳產學研合作示范基地 （寧德 352100）；3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心 （寧德352100）

抗氧化劑主要分為天然和化學合成2種類型。化學合成的抗氧化劑具有毒性、致癌性、致畸性等特點，使用過量的化學抗氧化劑會危害機體的健康[1-3]。因此，獲得高效無毒的天然抗氧化劑具有十分重要的意義。多酚是一種天然的抗氧化劑，能夠有效清除自由基[4-5]。植物多酚已被廣泛應用于水產品、果蔬及畜禽肉等制品的儲運和保鮮。植物多酚可作為食品添加劑延長食品的保質期[6]。研究植物多酚的成分和抗氧化活性，有助于新型食品添加劑的研發。

柳葉蠟梅（Chimonanthussalicifolius），又名毛山茶、山蠟梅，是一種藥食兩用的植物。柳葉蠟梅的用途廣泛，常用于制備食涼茶，別名黃金茶。柳葉蠟梅的應用有著悠久的歷史，并且在畬族藥物中運用極廣，被譽為“畬藥第一味”[7-8]。畬族百姓早在北宋時就已開始利用柳葉蠟梅來預防和醫治感冒。有研究表明柳葉蠟梅具有清熱解毒、理氣健脾、預防感冒、消暑解暑和消導止瀉等功效[9]。鄒永等[10]研究發現柳葉蠟梅提取物能夠減少急性胃黏膜損傷大鼠胃部的潰瘍面積，對保護胃黏膜具有積極的作用。溫慧萍等[11]研究發現柳葉蠟梅水提物具有止瀉的作用。張健健等[12]研究發現柳葉蠟梅提取物具有保肝的作用。市場上柳葉蠟梅相關食品相對較少。研究柳葉蠟梅酚類成分和體外抗氧化活性能為柳葉蠟梅在保健食品開發和應用提供理論基礎，具有良好的開發前景。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）銨鹽（ABTS）、福林酚、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、維生素E（北京索萊寶科技有限公司）；乙醇、氯化鐵、鐵氰化鉀、碳酸鈉、過硫酸鉀、氫氧化鈉、過氧化氫（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設備

TGL-21高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；FDU-2110冷凍干燥機、N-1300旋轉蒸發儀（日本東京理化有限公司）；Xevo TQ-S三重四極桿質譜（美國沃特世公司）；Varioskan LUX多功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Waters Acqutiy UPLC H-Class超高效液相色譜（美國沃特世公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 柳葉蠟梅醇提物的制備

將柳葉蠟梅葉片進行烘干處理，采用多功能粉碎機進行粉碎處理。取100 g柳葉蠟梅粉末，以1∶10 g/mL料液比加入70%的乙醇，水浴鍋中提取3 h（80 ℃），過濾去除殘渣。濾液采用旋轉蒸發儀進行濃縮，冷凍干燥后得到柳葉蠟梅醇提物。

1.2.2 總酚的測定

參照陳龍等[13]的方法測定總酚含量。分別將樣品溶液（200 μL）、蒸餾水（800 μL）和福林酚（200 μL）加入至10 mL離心管中，混勻后，避光靜置6 min。加入2 mL 7%的Na2CO3溶液和1.6 mL蒸餾水，混勻后，避光反應90 min。在波長760 nm處測定樣品的吸光度。通過沒食子酸標準曲線的回歸方程Y=0.001 8X+0.040 7（R2=0.992），計算總酚的含量。

1.2.3 酚類成分的測定

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積4 μL；流速0.2 mL/min。流動相A為0.1%甲酸水溶液+5 mmol/L的乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5 min，90%～10% A；5～6 min，10% A；6～8 min，10%～50% A；8～9 min，50%～90% A；9～10 min，90% A。

1.2.3.2 質譜條件

離子源為電噴霧電離（ESI）源；掃描方式為多級反應監測；毛細管電壓3.0 kV（正模式）、1.5 kV（負模式）；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃（正模式）、450 ℃（負模式）。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基的清除率參照楊娟等[14]的方法進行測定。準確稱取8 mg DPPH于50 mL離心管中，加入40 mL無水乙醇溶液，采用超聲處理5 min，使其充分混勻。將DPPH溶液在波長517 nm處的吸光度調至1.2～1.3。在96微孔板中加入100 μL的樣品溶液和100 μL的DPPH溶液，充分混勻后，避光靜置30 min，使用酶標儀測定波長519 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下獲得A2和A0。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A1為樣品與DPPH反應的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除率的測定

ABTS自由基的清除率參照陳曉寧等[15]的方法進行測定。將10 mL過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L）和10 mL的ABTS溶液（7.4 mmol/L）充分混勻后，避光靜置12 h。將ABTS工作液在波長734 nm處的吸光度調至0.7。將ABTS工作液（100 μL）和樣品溶液（100 μL）充分混勻后，避光反應6 min（25 ℃），使用酶標儀測定波長734 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。ABTS自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為樣品與ABTS反應的吸光度；A2為蒸餾水代替ABTS的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.6 羥自由基清除率的測定

羥自由基清除率的測定參照侯文井等[16]的方法進行測定。分別取1 mL的水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL的樣品溶液，1 mL的FeSO4溶液（9 mmol/L）和1 mL的H2O2溶液（9 mmol/L）置于15 mL玻璃試管中，混勻后，置于暗室，在37 ℃條件下反應30 min。使用酶標儀測定波長510 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。羥自由基清除率按式（3）計算。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.7 超氧陰離子自由基清除率的測定

超氧陰離子自由基清除率的測定參照周萍等[17]的方法進行測定。于15 mL玻璃試管中分別加入2 mL樣品溶液和2 mL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8），混勻后，于25 ℃靜置10 min。加入0.4 mL鄰苯三酚溶液（10 mmol/L），混勻后，25 ℃靜置5 min。加入0.2 mL鹽酸溶液（12 mol/L）終止反應。使用酶標儀測定波長325 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。超氧陰離子自由基清除率按式（4）計算。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.8 還原力的測定

參照魏奇等[18]的方法測定柳葉蠟梅醇提物的還原能力。于15 mL玻璃試管中分別加入2.5 mL樣品溶液、2.5 mL磷酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）、2.5 mL鐵氰化鉀溶液（10 mg/mL）混合均勻，在50 ℃條件下靜置20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸（100 mg/mL），混合均勻，離心（3 500 r/min，10 min）。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和1 mL氯化鐵溶液（1.0 mg/mL），混合均勻。使用酶標儀測定波長700 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。還原力按式（5）計算。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為樣品組本底的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.9 數據統計與分析

試驗重復次數為3次，應用SPSS 26軟件進行數據分析，通過Graph Prism 9.0軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 柳葉蠟梅醇提物酚類成分分析結果

柳葉蠟梅醇提物的總酚含量為169.18±2.49 mg/g。由表1可知，柳葉蠟梅醇提物的酚類成分主要為楊梅黃素、蘆丁、兒茶素、表兒茶素和綠原酸。柳葉蠟梅醇提物中楊梅黃素最高（42.46±4.37 mg/kg）。其中：槲皮素、蘆丁和楊梅黃素屬于黃酮醇類；兒茶素和表兒茶素屬于黃烷類；對香豆酸、原兒茶酸和丁香酸屬于酚酸類；綠原酸、阿魏酸和咖啡酸屬于苯丙素類。

表1 柳葉蠟梅醇提物酚類成分含量

2.2 柳葉蠟梅醇提物對ABTS自由基的清除作用

由圖1可知，在質量濃度為15.63 μg/mL時，水溶性維生素E能夠完全清除ABTS自由基。在15.63～31.25 μg/mL的質量濃度范圍內，ABTS自由基清除作用隨著柳葉蠟梅醇提物的質量濃度的增加而逐漸增強。質量濃度31.25～62.50 μg/mL時，柳葉蠟梅醇提物對ABTS自由基的清除率為99.96%±0.20%。柳葉蠟梅醇提物對ABTS自由基的半數清除濃度（IC50）為8.98 μg/mL。

圖1 柳葉蠟梅醇提物對ABTS自由基的清除能力

2.3 柳葉蠟梅醇提物對DPPH自由基的清除作用

如圖2所示，在31.25～500 μg/mL的質量濃度范圍內，柳葉蠟梅醇提物對DPPH自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強。質量濃度500 μg/mL時，柳葉蠟梅醇提物對DPPH自由基的清除率為87.21%±0.71%。在相同質量濃度的條件下，柳葉蠟梅醇提物對DPPH自由基的清除作用小于水溶性維生素E。柳葉蠟梅醇提物對DPPH自由基清除作用的IC50為46.10 μg/mL。

圖2 柳葉蠟梅醇提物對DPPH自由基的清除能力

2.4 柳葉蠟梅醇提物對羥自由基的清除作用

由圖3可知，水溶性維生素E質量濃度為5，10和20 mg/mL時，水溶性維生素E對羥自由基的清除作用沒有顯著性差異（P＞0.05）。柳葉蠟梅醇提物對羥自由基的清除率呈現逐漸增強的作用。柳葉蠟梅醇提物質量濃度20 mg/mL時，其對羥自由基的清除率為53.13%±2.52%。柳葉蠟梅醇提物對羥自由基清除作用的IC50值為16.21 mg/mL。

圖3 柳葉蠟梅醇提物對羥自由基的清除能力

2.5 柳葉蠟梅醇提物對超氧陰離子自由基的清除作用

如圖4所示，水溶性維生素E質量濃度0.50～8 mg/mL時，水溶性維生素E對超氧陰離子自由基的清除作用隨著其質量濃度增大而增強。質量濃度大于4 mg/mL時，柳葉蠟梅醇提物對超氧陰離子的清除作用強于水溶性維生素E。柳葉蠟梅醇提物的質量濃度8 mg/mL時，其超氧陰離子清除率達90.29%±1.34%。柳葉蠟梅醇提物的超氧陰離子清除率IC50值為2.85 mg/mL。

圖4 柳葉蠟梅醇提物對超氧陰離子自由基的清除能力

2.6 柳葉蠟梅醇提物還原能力的測定

如圖5所示，在0.31～5 mg/mL質量濃度范圍下，水溶性維生素E和柳葉蠟梅醇提物的還原能力均隨著其質量濃度的增加而增強。柳葉蠟梅醇提物質量濃度5.00 mg/mL時，其還原力大小為1.54±0.03，表現出一定的還原能力。

圖5 柳葉蠟梅醇提物還原能力

3 討論與結論

柳葉蠟梅是畬族藥食同源的植物，具有極高的食藥用價值，在食品、醫藥和美容等方面有著很好的應用前景。郭孝成等[19]研究發現柳葉蠟梅水提物和醇提物具有抗氧化活性。陳建煙[20]研究發現浙江蠟梅甲醇提取物具有強的清除DPPH自由基作用和還原力。趙梓桐等[21]研究發現柳葉蠟梅醇提物具有清除ABTS自由基和DPPH自由基的作用，與試驗結果一致。試驗表明柳葉蠟梅醇提物對ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基IC50的值分別為8.98 μg/mL，46.10 μg/mL，16.21 mg/mL和2.85 mg/mL。柳葉蠟梅醇提物具有體外清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基、羥自由基和ABTS自由基的作用，清除作用的效果大小依次為ABTS＞DPPH＞超氧陰離子＞羥自由基。

有研究表明柳葉蠟梅中富含蘆丁、槲皮素、山奈酚、表兒茶素、原花青素C及糖苷類物質[22-24]。潘心禾等[25]研究發現柳葉蠟梅乙醇提取物中含有槲皮素、7-羥基-6-甲氧基香豆素和山萘酚。孫啟[26]研究發現亮葉蠟梅葉乙醇提取物中含有較多的槲皮素、山奈酚和山奈酚衍生物。試驗測得柳葉蠟梅醇提物的總酚含量為169.18±2.49 mg/g。柳葉蠟梅提取物中主要酚類成分為楊梅黃素、蘆丁、兒茶素、表兒茶素和綠原酸。通過對柳葉蠟梅醇提物的抗氧化活性及酚類成分分析，為柳葉蠟梅活性成分的提取及天然食品保鮮劑的開發提供理論基礎。