基于GC-MS和UPLC法刺梨和無籽刺梨指紋圖譜研究

張得香，劉孟華，潘丹陽，林琳，徐崇，何敬愉,3*

1.廣州環亞化妝品科技股份有限公司 （廣州 510700）；2.南方醫科大學藥學院 （廣州 510515）；3.華南師范大學化學學院 （廣州510006）

刺梨（Rosaroxburghiitratt）和無籽刺梨（Rosasterilis）同屬薔薇科植物，是云貴高原及攀西高原特有的野生資源，其果實中含有豐富的營養物質，如維生素、人體必需氨基酸、蛋白質等。同時，刺梨和無籽刺梨中含有的黃酮類化合物、有機酸、多糖、超氧化物歧化酶（SOD），具有抗菌、抗衰老[1]、抗凋亡[2]、抗氧化[3]、抗動脈粥樣硬化等生物活性[4-7]。此外，刺梨和無籽刺梨中維生素C（VC）、維生素P（VP）及SOD含量在所有果蔬中均最高，享有“三王水果”之美譽，所以也常被加工成果酒、果醋、果汁飲料、果茶、果醬及滋補口服液等食品[8-9]。

近年來，由于刺梨和無籽刺梨密切的親緣關系，果實性狀相似，兩者在功能食品加工中出現混用現象。指紋圖譜技術是一種綜合、可量化的鑒定手段，能穩定、可靠地區分不同品種間的差異，被應用于食品的品種判別中[10]。對刺梨和無籽刺梨的研究報道主要集中在揮發油、氨基酸、微量元素、三萜皂苷和維生素C等營養物質[11-13]。但鮮有文獻系統比較刺梨和無籽刺梨營養成分差異。因此，選取刺梨和無籽刺梨各5批，采用GC-MS和UPLC法，構建刺梨和無籽刺梨揮發性成分和水溶性成分指紋圖譜，聯合使用聚類分析，探討刺梨和無籽刺梨揮發性成分和水溶性成分異同，為刺梨膳食補充、藥物制劑和疾病治療中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮刺梨S1～S5（安順、畢節、貴陽、黔東南、遵義）5批和無籽刺梨S6～S10（安順、貴陽、黔東南）5批各采于貴州省不同地區；其樣品信息如表1所示。

表1 10批刺梨和無籽刺梨樣品來源

咖啡酸、沒食子酸、槲皮素、槲皮苷、蘆丁和木犀草素標準品（阿拉丁）；甲醇、甲酸、正己烷（美國Merck公司）。

1.2 主要儀器設備

7890A/5975C氣質聯用儀（美國Agilent公司）；HP-5MS毛細管柱（美國Agilent公司）；BT25S電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；UPLC H08UPB902M液質聯用儀（美國Waters公司）；H1750R高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；高純水儀（美國Millipore）。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨和無籽刺梨揮發性成分的制備

采用水蒸氣餾法。取100 g鮮果，用高純水沖洗3遍后于破碎機打碎，置于500 mL錐形瓶中，加入200 mL高純水，于揮發油提取裝置中加熱3 h，待冷卻至室溫后，取油狀層用正己烷萃取，無水硫酸鈉干燥后用0.45 μm濾膜過濾于氣相色譜進樣瓶中待測。

1.3.2 刺梨和無籽刺梨水溶性成分的提取

為保證活性物質的穩定，每批次樣品各取500 g于硅膠中常溫干燥后用粉碎機粉碎并保存在干燥器中。準確稱取干粉1 g于50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇后超聲提取30 min，用濾紙過濾，取濾渣，加入25 mL甲醇超聲30 min后過濾，合并2次濾液并旋轉蒸發濃縮，用甲醇定容至10 mL容量瓶，得到刺梨和無籽刺梨提取液，用封口膜密封后置于4 ℃保存。離心（14 000 r/min）10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾于棕色容量瓶中待測。

1.3.3 對照品溶液的制備

稱取咖啡酸、沒食子酸、槲皮素、槲皮苷、蘆丁和木犀草素6種化學對照品適量，精密稱定，分別置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含上述樣品1 mg的對照品溶液。分別取對照品溶液各一定量置1 mL棕色量瓶中，作為對照品稀釋液；分別取對照品稀釋液一定量，置于同一1 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得終質量濃度分別為0.02，0.02，0.02，0.02，0.02和0.02 mg/mL的混合對照品溶液。

1.3.4 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；色譜升溫條件：初始溫度50 ℃，初始溫度保持1 min后，以15 ℃/min的速率升溫至160 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至280 ℃并保持5 min，載氣為高純He（純度99.999 5%），載氣流量2 mL/min，進樣量5 μL，不分流進樣。

質譜檢測條件：離子源為EI源，進樣口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質量范圍50～500 AMU，溶劑延遲時間3 min。

1.3.5 UPLC分析條件

UPLC色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC RBEH 18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；采用0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動相梯度洗脫；梯度條件見表2。進樣體積10 μL；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min，檢測波長254 nm。UPLC檢測色譜梯度條件見表2。

表2 UPLC檢測色譜梯度條件

1.3.6 指紋圖譜構建

根據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，將5批刺梨和5批無籽刺梨數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2012版，制定指紋圖譜，采用阿拉伯數字標出共有峰，用“S”標出參照物峰。以對照品指紋峰或峰面積較大、較穩定的共有峰作為參照峰，定義參照峰的峰面積作為1，計算其他各共有峰面積與參照物峰面積的比值，計算10批供試品的平均比值。非共有峰總面積不得大于總面積的10%。

1.3.7 相似度分析

以刺梨和無籽刺梨GC-MS指紋圖譜或HPLC指紋圖譜共有模式作為10批樣品指紋圖譜色譜峰匹配的依據，采用夾角余弦法計算各樣品指紋圖譜的相似度。

1.3.8 聚類分析

對5批刺梨和5批無籽刺梨GC-MS指紋圖譜分析，獲得共有峰，將各色譜峰相對內參比峰的峰面積量化，得到原始數據矩陣，運用SPSS 19.0軟件進行系統聚類分析，采用組間聯結法，利用歐式距離作為樣品的測度。

1.3.9 方法學考察

1.3.9.1 重復性試驗

取6份供試品遵義刺梨（S4），按照1.3.2的方法制備供試品溶液，按照1.3.5的色譜條件進樣，記錄其中6個共有色譜峰的保留時間和峰面積，以對照譜圖峰型較好的峰為參照峰（S），圖譜中各個峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算它們之間的SRSD。

1.3.9.2 穩定性試驗

取1份供試品無籽刺梨黔東南2（S10），按照1.3.2的方法制備供試品溶液，按照1.3.5的色譜條件進樣，在0，4，8，16和24 h記錄色譜圖，記錄其中6個共有色譜峰的保留時間和峰面積，以對照譜圖峰型較好的峰為參照峰（S），圖譜中各個峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算它們之間的SRSD。

1.3.10 數據處理

氣質數據采用MSD ChemStation E.02.02.1431軟件（Agilent）進行處理。未知化合物質譜圖經計算機檢索同時與NIST 05 library質譜庫相匹配，并結合人工圖譜解析及資料分析，僅報道匹配度均大于85（最大值100）的鑒定結果。

液相數據采用MssLynx V4.1（Waters）工作站進行記錄和處理。

2 結果與分析

2.1 GC-MS結果

2.1.1 GC-MS指紋圖譜建立

將5批刺梨和5批無籽刺梨樣品GC-MS數據導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版本）”軟件進行處理，分別生成刺梨和無籽刺梨指紋圖譜。5批刺梨樣品中S3樣品和無籽刺梨S6樣品色譜圖中色譜峰峰型、分離度良好，基線平整，故擇其為參照指紋圖譜。選擇中位數法作為對照指紋圖譜的生成方法，時間窗寬度設為0.1，對色譜峰進行全譜峰匹配。結果如圖1所示。

圖1 刺梨和無籽刺梨色譜峰匹配圖

圖2 聚類分析結果

2.1.2 相似度評價

利用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版本）”軟件對5批不同產地的刺梨和5批不同產地的無籽刺梨揮發性成分進行相似度評價，結果見表3和表4。

表3 刺梨相似度評價

表4 無籽刺梨相似度評價

5批刺梨樣品相似度范圍在0.757～0.917之間，說明不同產地刺梨揮發性成分存在一定差異，貴陽和黔東南地區產樣品S3和S4與對照指紋圖譜相比相似度均大于0.9，安順和遵義地區產樣品S1和S5與對照指紋圖譜相比相似度均小于0.8，說明貴陽和黔東南地區產的刺梨揮發性成分和質量較接近，安順和遵義地區產的無籽刺梨揮發性成分和質量存在一定差異。

5批無籽刺梨樣品相似度范圍在0.358～0.816之間，說明不同產地和同一產地不同批次無籽刺梨揮發性成分存在一定差異，同為安順地區產的無籽刺梨S6和S7樣品與對照指紋圖譜相比相似度相差2.3倍，同樣的，同為黔東南地區產的無籽刺梨S9和S10樣品與對照指紋圖譜相比相似度相差1.6倍，S6、S8、S9、S10樣品與對照指紋圖譜相比相似度均小于0.8，說明不同地區產的無籽刺梨揮發性成分和質量存在很大差異，而同一地區產的無籽刺梨不同批次揮發性成分和質量同樣存在很大差異。

2.1.3 聚類分析

將5批刺梨與5批無籽刺梨指紋圖譜中67個色譜峰的相對峰面積數據（表5）導入SPSS軟件中，采用歐式距離對5批刺梨與5批無籽刺梨進行聚類分析，結果見圖3。

圖3 刺梨和無籽刺梨色譜峰匹配圖

表5 刺梨和無籽刺梨67個色譜峰的相對峰面積值

聚類結果分為3類時，第1類為S6，第2類為S5和S8，第3類為S3、S4、S2、S1、S7、S10和S9。第3類中的刺梨藥材主要集中于貴州省的西北部，結合指紋圖譜與相似度評價，可見這幾批刺梨藥材的揮發性成分較相似。研究表明，影響植物揮發性成分的因素包括樹種、光照、溫度和臭氧等[14-15]，結合指紋圖譜與相似度評價，產自安順的無籽刺梨S6與其他樣品差異較大，且S6與同一產地不同批次的S7不成一類，其原因可能為因地理位置和品種的不同，使得產生揮發性成分相關酶（β-氧化酶）的活性或者專一性不同，造成揮發性成分的轉化速率和比例不同，導致2種刺梨果實揮發性成分濃度有差異[16]。

2.2 UPLC結果

2.2.1 UPLC指紋圖譜建立

將5批刺梨和5批無籽刺梨樣品UPLC數據導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版本）”軟件進行處理，分別生成刺梨和無籽刺梨指紋圖譜。5批刺梨樣品中刺梨S3樣品和無籽刺梨S7樣品色譜圖中色譜峰峰型、分離度良好，基線平整，故擇其為參照指紋圖譜。選擇中位數法作為對照指紋圖譜的生成方法，時間窗寬度設為0.1，對色譜峰進行全譜峰匹配。

如圖3所示，從5批刺梨和5批無籽刺梨樣品的指紋圖譜中通過與對照品色譜圖中的保留時間比較，初步可指認5個共有峰，其中3號峰的分離度較好，且位置較居中，則以其為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間。

植物黃酮類成分是一種被廣泛認可的天然抗氧化劑，同時具備抗抑菌、降血脂和抗腫瘤等作用，其中蘆丁是有效成分之一，具有很好的抑菌、抗炎等作用[17]。有研究表明，從刺梨中提取的蘆丁對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌等有明顯的抑菌效果[18]。由圖3可知，不同產地刺梨和無籽刺梨中黃酮類含量具有較大差異，其中刺梨中蘆丁的含量較無籽刺梨高。由于無籽刺梨中關于黃酮類的研究較少，所以刺梨和無籽刺梨中黃酮類含量差異需要進一步研究確定。

2.2.2 相似度評價

利用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版本）”軟件對5批不同產地的刺梨和5批不同產地的無籽刺梨水溶性成分進行相似度評價，結果見表6和表7。

表6 刺梨相似度評價

表7 無籽刺梨相似度評價

由表6可知，5批刺梨樣品指紋圖譜與對照圖譜相似度范圍在0.885～0.977之間，其中樣品S1、S2、S4、S5與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，存在的差異比較小，說明刺梨S1、S2、S4、S5中水溶性成分比較接近，受地理環境的影響較小；而產自貴陽的刺梨樣品S3與其他產地樣品相比水溶性物質相似度較小。

由表7可知，5批無籽刺梨樣品相似度范圍在0.790～0.904之間，其中產自安順地區的無籽刺梨S6和S7相似度大于0.9，可認為兩者差異較小；而S8、S9和S10指紋圖譜與對照圖譜相比，相似度均在0.9以下，其中S9和S10差異較大，其可能原因是采收時間不同，導致兩者水溶性成分存在一定差異。相比于不同產地的刺梨，不同產地的無籽刺梨水溶性成分差異較大。

2.2.3 聚類分析

將5批刺梨與5批無籽刺梨指紋圖譜中12個共有色譜峰的峰面積數據（表8）導入SPSS軟件中，采用歐式距離對5批刺梨與5批無籽刺梨進行聚類分析，結果見圖4。

圖4 聚類分析結果

表8 刺梨和無籽刺梨共有色譜峰的峰面積值

由圖4結果可知，經過聚類分析，聚類結果可分為A、B、C兩大類，分別為A，S3；B，S1、S2、S4、S5；C，S6、S7、S8、S9、S10。由分析可知，不同產地的無籽刺梨可歸為一類。植物水溶性成分含量可能與土壤中微量元素（如錳、鉀或氮）、水分含量或者pH的大小有關[19-20]。圖4結果中產地為貴陽的樣品S3獨自成一類，結合指紋圖譜與相似度評價，可能原因為由于土壤微量元素、水分或pH影響導致該產地的刺梨與其他產地的刺梨水溶性成分具有一定差異性[21]。但是具體影響因素還需進一步研究。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 重復性試驗

稱取供試品遵義刺梨1份，按照1.3.2的方法制備供試品溶液，1.3.5的色譜條件進樣，記錄色譜圖。主要5個色譜峰的保留時間和相對峰面積的SRSD結果如表9，相對保留時間SRSD均小于1.0%，相對峰面積SRSD均小于1.0%，表明該方法重復性較好。

表9 相對保留時間和相對峰面積的SRSD 單位：%

2.2.4.2 穩定性試驗

稱取1份供試品無籽刺梨（黔東南），按照1.3.2的方法制備供試品溶液，按照1.3.5的色譜條件進樣，在0，4，8，16和24 h記錄色譜圖。記錄色譜圖。主要5個色譜峰的保留時間和相對峰面積的SRSD結果如表10所示。結果表明，測得主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積SRSD均小于1.0%。即此供試品溶液在24 h內較穩定。

表10 相對保留時間和相對峰面積的SRSD 單位：%

3 結論

試驗主要以來自不同產地的刺梨和無籽刺梨各5批為原料，通過GC-MS和UPLC法記錄色譜圖，結合相似度評價、聚類分析方法對其成分差異進行比較。結果表明，相比于刺梨，無籽刺梨揮發性成分相似度普遍偏小，說明無籽刺梨間揮發性成分的差異較大，來自地理位置較集中的區域的刺梨和無籽刺梨在揮發性成分上比較接近；而兩者的水溶性成分（主要分析對象為黃酮類成分）則有一定差異。試驗成果對刺梨和無籽刺梨在食品或者醫藥行業的開發利用提供參考。