UPLC-MS/MS測(cè)定羊奶和羊奶粉中安乃近殘留量

李璐，楊家秀，王聰，董文君，張艷*

1.富平縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心 （陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心）（富平 711700）；2.陜西圣唐乳業(yè)有限公司 （富平711700）

安乃近（metamizole sodium），是氨基比林和亞硫酸鈉的絡(luò)合物，屬于吡唑酮類的非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，通過(guò)抑制前列腺素（PG）合成酶（環(huán)氧酶，COX-1、COX-2和COX-3），減少前列腺素合成而發(fā)揮藥效[1]。人因個(gè)體差異或不當(dāng)使用會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如皮疹、壞死性腸炎、再生障礙性貧血、肝腎功能異常、過(guò)敏性休克等[1]，美國(guó)、澳大利亞、日本等30多個(gè)國(guó)家已禁用或限用該藥。2020年我國(guó)停止安乃近注射液等品種的使用[2]，修訂安乃近片對(duì)妊娠晚期婦女和18歲以下青少年兒童禁用[3]。安乃近是獸醫(yī)臨床常用的治療藥物，對(duì)大型家畜的使用產(chǎn)生的不良反應(yīng)通常不被人們重視。肌肉給藥24 h后，牛奶中殘留標(biāo)志物4-甲基氨基安替比林濃度占總殘留的比例為27%[1]，羊奶中代謝殘留研究尚未見(jiàn)諸報(bào)道。國(guó)家要求食品動(dòng)物的休藥期為28日，禁奶期為7日[4]，準(zhǔn)確檢測(cè)安乃近的殘留量成為市場(chǎng)監(jiān)管的必然要求。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定安乃近在羊奶中的最大殘留限量為50 μg/kg[5]，與歐盟標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定相同[6]，羊奶粉根據(jù)出粉率折算成羊奶進(jìn)行判定。

安乃近的檢測(cè)方法有分光光度法[7]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光光度法[8]、薄層色譜法[9]、液相色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[11]，其中超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）技術(shù)有助于降低內(nèi)源性物質(zhì)的干擾[12]，適用于痕量藥物殘留的測(cè)定[13]。羊奶與牛奶的營(yíng)養(yǎng)素構(gòu)成和維生素、礦物質(zhì)含量存在明顯差異[14]，所以亟須建立針對(duì)羊奶和羊奶粉中安乃近殘留量的檢測(cè)方法，對(duì)日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及地理標(biāo)志產(chǎn)品的保護(hù)均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，純度≥ 99.1%）、4-乙酰氨基安替比林（4-acetylaminbantipyrine，純度≥99.9%）、4-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine，純度≥99.9%）：天津阿爾塔科技有限公司；4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine，純度≥99.9%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；4-異丙基氨基安替比林-D6（4-isopropylantipyrine-D6，純度≥99.9%，北京曼哈格生物科技有限公司）；甲酸、乙酸銨、異丙醇（色譜純，阿拉丁試劑有限公司）；甲醇、乙酸、乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；羊奶和羊奶粉（陜西圣唐乳業(yè)有限公司）。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀1290-G6460C（配ESI離子源，美國(guó)安捷倫公司）；BEH C18色譜柱（柱長(zhǎng)50 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.8 μm，美國(guó)安捷倫公司）；MTN-5800A-24氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；H20-I-1-UV-T超純水機(jī)（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相洗脫條件和質(zhì)譜條件的選擇

分離條件以GB/T 22971—2008《牛奶和奶粉中安乃近代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[15]為基礎(chǔ)，依據(jù)儀器條件和色譜柱的不同進(jìn)行調(diào)整，使4個(gè)組分能充分被識(shí)別。

1.2.2 樣品制備方式的選擇

按照提取、濃縮的步驟制備試樣，以回收率和精密度考察方法的準(zhǔn)確性?；厥章实挠?jì)算參考GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[16]中附錄F的F.1，精密度參考F.3。

1.2.3 定量限的測(cè)定

在羊奶和羊奶粉中添加目標(biāo)化合物，做平行樣，測(cè)基線噪音值，依據(jù)特征離子色譜峰rSN＞10為方法定量限[16]，測(cè)定方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相洗脫條件和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件

色譜柱C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫：0～4.0 min、90%～75% A，4.0～6.0 min、75%～70% A，6.0～10.0 min、70%～90% A；流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電離方式ESI+；霧化器壓力35 Psi；毛細(xì)管電壓2 500 V；干燥氣溫度325 ℃；干燥氣流速12 L/min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式?；衔锏钠渌麉?shù)見(jiàn)表1。

表1 各組分質(zhì)譜分析參數(shù)

有機(jī)相采用甲醇時(shí)，由于第1個(gè)峰出峰早，所以出現(xiàn)肩峰現(xiàn)象，更換有機(jī)相為乙腈后峰形完好，調(diào)整使用乙腈作為有機(jī)相。當(dāng)使用0.1%甲酸時(shí)，室溫下流動(dòng)相的pH約2.5，并且同加入乙酸銨和乙酸時(shí)峰形和峰面積差異不顯著，所以不使用乙酸銨和乙酸作為流動(dòng)相，也避免鹽類對(duì)質(zhì)譜可能造成的損害。優(yōu)化洗脫梯度后（見(jiàn)2.1.1），4個(gè)組分得到有效識(shí)別，濃度約100μg/L時(shí)的結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 總離子流圖及定量多反應(yīng)監(jiān)測(cè)結(jié)果

2.2 提取條件的優(yōu)化

為避免羊奶中含有大量的小分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)的干擾，采用增大乙腈加入量進(jìn)行提取，并且減少提取次數(shù)至1次，避免多次提取時(shí)小分子化合物使溶液渾濁，以減少基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的不良影響，也簡(jiǎn)化了提取步驟，提高了提取效率。

2.3 樣品制備

稱取5.00 g羊奶，置于50 mL帶刻度的聚丙烯離心管中，加入50 μL 1.0 mg/L內(nèi)標(biāo)工作溶液、0.5 mL 1.0 mol/L的Tris溶液及20 mL乙腈，渦旋混合1 min，振蕩提取15 min，于4 ℃，5 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，作為提取液。取5.0 mL提取液至10 mL玻璃刻度管中，加入5.0 mL異丙醇，混勻，于40 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL初始流動(dòng)相溶解，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

稱取12.5 g羊奶粉于100 mL燒杯中，加適量水（35～50 ℃）溶解，冷卻后加水至總質(zhì)量100 g，混勻，按照上述羊奶的步驟處理。

2.4 內(nèi)標(biāo)量的優(yōu)化

4-甲基氨基安替比林的測(cè)定采用4-異丙基氨基安替比林-D6作為同位素內(nèi)標(biāo)。選定內(nèi)標(biāo)化合物之后，關(guān)鍵在于確定合適的內(nèi)標(biāo)濃度[17]。內(nèi)標(biāo)濃度太大，前處理時(shí)損失的內(nèi)標(biāo)量也多，出于經(jīng)濟(jì)節(jié)約考慮，在能夠滿足測(cè)定需求的前提下，內(nèi)標(biāo)的上機(jī)濃度選為最低濃度10 μg/L。

2.5 線性范圍、線性方程和定量限

吸取約0，50，250，500，1 000，2 000和5 000 μL 0.2 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液及100 μL 1.0 mg/L內(nèi)標(biāo)工作溶液，用空白基質(zhì)溶液定容至10 mL容量瓶中，得到基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林采用外標(biāo)法定量，4-甲基氨基安替比林以4-異丙基氨基安替比林-D6作為內(nèi)標(biāo)采用內(nèi)標(biāo)法定量。以峰面積（或與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值）（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸擬合，各組分回歸方程結(jié)果如表2所示。相關(guān)系數(shù)R2＞0.995，線性關(guān)系良好，符合要求。

表2 4種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)

按照定量限的測(cè)定方法，離子色譜峰rSN＞10，測(cè)定定量限。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林的定量限分別為2.8，3.9，0.088和1.4 μg/kg。

2.6 重復(fù)性

在羊奶和羊奶粉樣品中分別添加約5和40 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，計(jì)算變異系數(shù)（C.V.），結(jié)果見(jiàn)表3。變異系數(shù)為0.3%～ 2.0%，符合要求。

表3 羊奶和羊奶粉中安乃近的重復(fù)性（n=6）

2.7 回收率和精密度

在樣品基質(zhì)中添加4個(gè)水平（羊奶約5，10，20和50 μg/kg；羊奶粉約40，80，160和400 μg/kg）的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，4個(gè)組分的回收率為83.6%～100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為0.3%～ 6.5%，方法的回收率和精密度能夠滿足定量分析要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。回收率按式（1）計(jì)算。

表4 羊奶和羊奶粉中安乃近的回收率和精密度（n=6）

回收率=（測(cè)得值-本底值）/添加量×100%（1）

2.8 樣品檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)抽取市場(chǎng)上3份樣品同質(zhì)控樣品一并按照上述建立的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。抽取的羊奶樣品均沒(méi)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的安乃近的最大殘留限量50 μg/kg。一般情況下羊奶粉的出粉率約12.5%，安乃近的最大殘留限量折算成羊奶粉約400 μg/kg，抽取的羊奶粉樣品也沒(méi)超過(guò)該值。并且質(zhì)控樣品測(cè)得值準(zhǔn)確可靠，這3份樣品中安乃近殘留量遠(yuǎn)不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生傷害作用。

3 結(jié)論

羊奶和羊奶粉復(fù)溶后加入Tris溶液，采用乙腈沉淀蛋白并提取安乃近殘留物，等量加入異丙醇促進(jìn)氮吹濃縮的方式，建立一種超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林殘留量的方法。該方法前處理操作簡(jiǎn)單，節(jié)約試劑耗材，用時(shí)短，既靈敏又準(zhǔn)確，具有一定優(yōu)越性，能夠很好地測(cè)定羊奶和羊奶粉中安乃近殘留量，可用于日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，提高市場(chǎng)監(jiān)管水平。