高效液相色譜-紫外檢測分析木槿花多糖水解單糖組分

孫盼盼，王靜，曹際云

德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 （德州253023）

木槿，別名佛桑花、籬障花，是錦葵科木槿屬，落葉灌木。其軀干高大，花朵長于枝端葉腋間，花萼和花均為鐘形，淡紫色。外有纖毛和星狀長柔毛。木槿原產(chǎn)于中國，大多數(shù)地區(qū)均有分布。其適應(yīng)性強(qiáng)，耐高溫耐寒冷。抗病蟲能力強(qiáng)，病害較少，生命力頑強(qiáng)。木槿花性涼，味甘、苦。內(nèi)服可清熱解毒和潤肺止咳，外敷可用于治療瘡癤、癰腫、燙傷的癥狀。它屬于一味中藥材，具有良好的醫(yī)用價值。在我國的廣東、浙江地區(qū)木槿花早已融入食材中，如用木槿花與小米或者玉米面熬粥，木槿花炒雞蛋，或者作為配菜放入餅或肉湯里作為中裝飾和提味[1]。

多糖是由10個以上的單糖分子縮合、失水而成的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì)，在自然界分布廣泛，是生物體的重要組成成分。近年來，隨著多糖研究的不斷深入，多糖的分離、純化、分析等取得非常大的進(jìn)展。植物多糖是一種天然產(chǎn)物，種類繁多，來源廣泛。已了解到的植物多糖生物學(xué)功能有免疫調(diào)節(jié)、降血糖。抗氧化、抗腫瘤和抗癌等[2-4]。基于多糖獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，加上我國豐富的植物資源，多糖的科學(xué)研究勢必有廣闊發(fā)展前景。

高效液相色譜又稱“高壓液相色譜”，是以高壓下的液體為流動相，樣品各組分溶于流動相并經(jīng)過固定相時，與固定相發(fā)生作用，通過組分在固定相停留的時間的不同，從而對組分進(jìn)行定性。高效液相色譜法靈敏度高、穩(wěn)定性好、分離效能高，已成為多糖的分離和測定的重要途徑。

試驗(yàn)使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化法，對木槿花多糖和標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行高效液相色譜分析，對木槿花多糖水解單糖組分分析和含量進(jìn)行鑒別和分析。木槿花多糖經(jīng)3 mol/L鹽酸水解后，與標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行PMP衍生化。采用C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1 mol/L的乙酸銨溶液（pH 6.9）和乙腈為流動相，在250 nm波長檢測[5]。通過多糖各組分的滯留時間和標(biāo)準(zhǔn)品單糖的保留時間進(jìn)行對比，對木槿多糖進(jìn)行定性分析；建立標(biāo)準(zhǔn)品單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對木槿單糖進(jìn)行定量分析[6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UltiMate3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；TGL-16R型臺式醫(yī)用離心機(jī)（山東百歐醫(yī)療科技有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S-3L型油浴鍋（江蘇科技儀器公司）；PHS-3C型數(shù)顯臺式酸度計（蘇珀儀器有限公司）。

苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（分析純）、乙酸鈉（色譜純）：科密歐化學(xué)試劑有限公司；D-木糖、D-半乳糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、L-鼠李糖一水物（合肥博美生物科技公司）；甲醇、乙腈（均為色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑公司）；三氯甲烷（分析純，北京化工廠）；所用水均為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的制備

取木槿花粉末若干，置于索氏提取器中，對木槿花粉末進(jìn)行脫脂處理，3 h脫脂3次后烘干備用。用適量蒸餾水溶解，放置與超聲破壁機(jī)中，進(jìn)行熱水浸提，提取后進(jìn)行抽濾，抽濾后得到浸提液，乙醇沉提并離心，得到多糖沉淀，用蒸餾水溶解多糖沉淀。加入一定體積正丁醇-氯仿進(jìn)行除蛋白操作，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心15 min，棄去沉淀，得到木槿花多糖溶液。冷凍干燥，即為粗多糖。

1.2.2 多糖測定

1.2.2.1 色譜條件

C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），波長250 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。流動相A為0.1 mol/L的乙酸銨溶液（pH 6.9），流動相B為乙腈（色譜純）。流動相皆過膜（乙酸銨-水系膜0.45 μm，乙腈-有機(jī)系膜0.45 μm）且超聲處理，超聲功率設(shè)置為50 kHz，時間15 min。

1.2.2.2 木槿花多糖處理

稱取10 mg經(jīng)過除脂、除蛋白的木槿花粗多糖，加1 mL水溶解。加入1 mL的3 mol/L鹽酸，渦旋振蕩5 min。于110 ℃油浴1 h，冷卻后，加入NaOH溶液將溶液調(diào)pH至中性，加入300 μL 0.5 mol/L的PMP溶液和200 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液。混勻振蕩5 min，于70 ℃熱水浴1 h。冷卻到室溫，加入0.5 mol/L鹽酸調(diào)pH為中性。用1 mL的三氯甲烷進(jìn)行萃取，振蕩5 min，將離心機(jī)設(shè)置成6 000 r/min，離心5 min，離心后棄去氯仿層，如此重復(fù)3次，將上清液用0.22 μL水系膜過濾。超聲15 min。

1.2.2.3 單糖與多糖衍生反應(yīng)

將各標(biāo)準(zhǔn)單糖配制為10 mg/mL，分別取200 μL各標(biāo)準(zhǔn)單糖，分別加入300 μL 0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液和200 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液。混勻振蕩5 min，于70 ℃熱水浴1 h。冷卻到室溫，加入0.5 mol/L鹽酸調(diào)pH為中性。加入1 mL三氯甲烷溶液進(jìn)行萃取，渦旋振蕩5 min，進(jìn)行離心（6 000 r/min，5 min），留上清液，重復(fù)3次，采用0.22 μL水系膜過濾。超聲15 min，用于HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖流動相的選擇

取經(jīng)過處理的木槿花多糖，采用不同比例的乙腈和乙酸銨溶液組成的流動相進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖1所示。第2種洗脫機(jī)制的出峰效果要好，分離度好；第1種洗脫機(jī)制出峰效果一般，分離度差；第3種洗脫機(jī)制出峰效果差，分離度一般。綜上選擇第2種洗脫機(jī)制乙酸銨-乙腈=80+20（V/V）進(jìn)行多糖和各單糖的洗脫。

圖1 木槿花多糖PMP衍生物HPLC

2.2 單糖衍生物HPLC定性分析

采用PMP衍生化法，制備一系列梯度濃度的7種標(biāo)準(zhǔn)品單糖試劑溶液，按照1.2.2.3步驟進(jìn)行處理，并在1.2.2.1條件下進(jìn)行HPLC定性分析，如圖2所示，得到甘露糖、無水葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸7種單糖衍生物在HPLC中與背景物質(zhì)的基線分離情況。圖譜顯示，單糖衍生物的紫外吸收峰信號與濃度呈正比。

圖2 各標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生物的HPLC定性分析

2.3 線性關(guān)系、定量限與木槿多糖中各單糖的含量

得到各種標(biāo)準(zhǔn)品的峰吸收面積后，以單糖濃度和峰面積分為橫、縱坐標(biāo)建立線性回歸方程，如表1所示。單糖的濃度與目標(biāo)峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2在0.95～0.99（木糖R2為0.95，半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖的R2為0.99）之間。甘露糖、無水葡萄糖、半乳糖定限量為0.5 mg/kg，其他單糖定限量為0.05 mg/kg。通過線性方程得出，各單糖的質(zhì)量濃度分別為0，0.028，0.137，0.150，0.107，0.192和0.065 mg/mL，繼而得出木槿多糖中各單糖含量分別為0，0.3%，1.3%，1.4%，1.0%，1.8%和0.6%（表1）。

表1 7種單糖的線性方程、相關(guān)系數(shù)、多糖中單糖的濃度及含量

3 結(jié)論

利用柱前衍生化法建立多糖水解的HPLC-UV分析技術(shù)，分析木槿花多糖水解的組成和含量。研究并鑒別木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、無水葡萄糖7種單糖組分，將其應(yīng)用于木槿花多糖提取液樣品含量分析，結(jié)果顯示7種單糖的含量為1.0%，1.3%，1.4%，0.6%，0，1.8%和0.3%。可得木槿花多糖中不含甘露糖，且鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖占比較多。與其他技術(shù)相比，HPLC-UV操作較為簡單、檢測穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)多糖多組分的定量分析，可為木槿花多糖水解單糖組分分析及含量的測定提供重要依據(jù)。