黑木耳菌絲老化過程中生理酶變化及其與胞外酶相關性分析

龐杰 于傳宗 李亞嬌 王海燕 孫國琴

摘要? 研究黑木耳菌絲老化過程中生理酶的變化，以及生理酶與胞外酶的相關性，結果表明：黑木耳菌絲老化過程中過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）呈先上升后下降的趨勢，多酚氧化酶（PPO）、丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）均呈下降趨勢。通過相關性分析發現，胞外酶與抗氧化酶系統、MDA、Pro存在相關性，表明抗氧化酶系統與胞外酶系統存在內在聯系，這有待進一步進行研究。

關鍵詞? 黑木耳菌絲體；老化；生理酶；胞外酶

中圖分類號? S646.6? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）04-0027-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.007

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Changes of Physiological Enzymes and Their Correlation with Extracellular Enzymes During the Aging of Auricularia auricula Hypha

PANG Jie， YU Chuan.zong， LI Ya.jiao et al

（Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences， Hohhot， Inner Mongolia 010030）

Abstract? This study investigated the physiological enzyme changes during the aging process of Auricularia auricula mycelium and their correlation with extracellular enzymes， it was found that the peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） of Auricularia auricula myceliumhypha increased first and then decreased， while the polyphenol oxidase （PPO）， malondialdehyde （MDA） and proline （Pro） all decreased. Through correlation analysis， it was found that there was a high correlation between extracellular enzyme and antioxidant enzyme system， MDA， Pro， indicating that there was an internal relationship between antioxidant enzyme system and extracellular enzyme system， which needs further research.

Key words? Auricularia auricula mycelium;Aging;Antioxidant enzyme;Extracellular enzyme

基金項目? 2021內蒙古自治區自然基金項目“老化過程對黑木耳菌絲體胞外酶和代謝組學的影響”（2021BS03047）；2022年內蒙古科技計劃項目“內蒙古黃河流域日光溫室食用菌工廠化生產及秸稈基質開發與利用技術研究”（2022YFHH0110）；2022年內蒙古農牧業科學院創新基金項目“自治區特色優勢食用菌工廠化高效栽培技術研究與基礎”（2022CXJJN01-2）。

作者簡介? 龐杰（1986—），男，蒙古族，內蒙古呼和浩特人，副研究員，博士，從事食用菌種質資源與種質創新研究。*通信作者，研究員，從事食用菌種質資源與種質創新研究。

收稿日期? 2023-05-09

老化是食用菌生產中最常發生的問題之一，老化的菌種生命力下降，抗雜菌能力弱，出耳遲，直接影響到菌絲的生長及子實體的產量和品質［1-2］。由于老化現象存在一定的隱蔽性，大量研究集中在形態觀測上［3-4］，目前還缺乏相關量化的生理觀測指標，對于黑木耳菌絲老化生理也有待進一步研究。

菌種生理活性指標是通過一系列生理生化檢測手段，獲得量化的菌絲體代謝數據，以此來評價菌種活力的一種方式［5］。“自由基理論”（FRTA）是近年來各種生物系統中老化研究的主要理論之一，當自由基產生過多時，會出現細胞損傷、器官衰老甚至生物體老化等狀況［6］。李敏等［7］研究發現，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量等可作為菌絲體活力的評價指標。許修宏等［8］研究添加物對木耳液體菌種老化的影響中發現，黑木耳SOD、過氧化物酶（POD）等活性也與菌絲老化密切相關。在食用菌研究領域，前人研究發現，胞外酶類分泌和菌齡存在相關關系，王云靈［9］研究發現，纖維素酶和蛋白酶活性與菌齡呈顯著負相關，多酚氧化酶與菌齡呈極顯著正相關性。陳軍等［10］研究發現，纖維素酶已經成為菌種活力強弱的檢驗指標。

因此，筆者測定了老化過程中黑木耳菌絲體的生理酶，研究生理酶與胞外酶存在的相關性，以期探究黑木耳菌絲在老化過程中的生理反應，為黑木耳老化研究奠定理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗菌株

為實驗室保藏的黑木耳菌株。

1.2? 試驗處理

培養基配方為PDA培養基40 g，酵母粉3 g定容至1 L水中，高壓滅菌后分裝至9 mm玻璃培養皿中，老化處理培養皿中每皿加入20 mL基質。將活化的黑木耳菌種接種至老化處理培養皿中，放置23 ℃下培養，待菌絲長滿培養皿即開始取樣（CK），以后每隔10 d取樣1次，取樣后將培養皿放置在-80 ℃冰箱保藏備用。

1.3? 生理酶測定

取樣8次（分別為處理①（CK）、處理②～⑧）后菌絲體發生大量自溶，以后不再取樣。將培養皿從-80 ℃依次通過-20、0 ℃解凍，取1/4培養皿中培養基放置在裝有100 mL滅菌水的無菌三角瓶中，放置在振蕩搖床中（80 r/min）4 h，取上清液測定抗氧化生理酶。抗氧化生理酶含量采用試劑盒測定（蘇州格銳思生物科技有限公司）。

1.4? 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0進行數據分析。

2? 結果與分析

2.1? 老化過程中生理酶變化情況

從圖1可以看出，黑木耳菌絲體在老化過程中菌絲體抗氧化生理酶的變化趨勢各不相同，其中POD、SOD和過氧化氫酶（CAT）變化趨勢基本一致，呈先上升后下降的趨勢，POD最高值在處理⑥，處理④、處理⑤、處理⑥之間差異不顯著（P>0.05），高于其他處理；SOD最高值在處理⑤，處理④、處理⑤、處理⑥、處理⑦間差異不顯著（P>0.05），顯著高于其他處理（P<0.05）；CAT最高值在處理⑥，且與處理⑦間差異不顯著（P>0.05），顯著高于CK、處理②、處理③、處理④（P<0.05），CK、處理②、處理③、處理④、處理⑤、處理⑧之間差異不顯著（P>0.05）。多酚氧化酶（PPO）呈快速下降趨勢，CK顯著高于其他（P<0.05），處理③、處理④、處理⑤、處理⑥、處理⑦、處理⑧間差異不顯著（P>0.05）。

2.2? 老化過程中MDA、脯氨酸（Pro）變化情況

從圖2可以看出，老化過程中菌絲體MDA和Pro含量均呈下降趨勢，MDA含量CK、處理②、處理③、處理④、處理⑤間差異不顯著（P>0.05），后續處理快速下降；Pro含量CK顯著高于其他處理（P<0.05），處理③、處理④、處理⑤、處理⑥、處理⑦、處理⑧間差異不顯著（P>0.05）。

2.3? 生理酶與胞外酶相關性分析

進一步對老化過程中黑木耳菌絲體生理酶與濾紙酶、半纖維素酶、纖維素酶、漆酶、淀粉酶、果膠酶、纖維二糖酶7種胞外酶進行相關性分析，發現老化過程中PPO與5種胞外酶呈極顯著正相關（P<0.01），與淀粉酶和纖維二糖酶不存在相關性。CAT與纖維素酶呈極顯著負相關（P<0.01），與半纖維素酶、漆酶、淀粉酶呈顯著負相關（P<0.05）。SOD與纖維素酶呈極顯著負相關（P<0.01），與纖維二糖酶呈極顯著正相關（P<0.01），與濾紙酶呈顯著負相關（P<0.05）。POD與纖維二糖酶呈極顯著正相關（P<0.01）。MDA與半纖維素酶、纖維素酶、漆酶、淀粉酶呈極顯著正相關（P<0.01），與果膠酶、纖維二糖酶呈顯著正相關（P<0.05）。Pro與濾紙酶、半纖維素酶、纖維素酶、漆酶、果膠酶呈極顯著正相關（P<0.01），與淀粉酶呈顯著正相關（P<0.05）（表1）。

3? 討論

SOD是抗氧化酶的第一道防線［11］，CAT在所有酶中清除活性氧效率最高［12］，上述酶活性下降會導致菌絲細胞內活性氧的快速積累。測定發現，黑木耳抗氧化酶SOD從第45天開始上升，105 d開始下降，CAT從第60天開始上升，105? d開始下降，表明105 d后黑木耳菌絲的活性氧快速積累。這與朱海峰［13］研究結果相印證，即黑木耳菌絲老化過程中自由基產生也在呈上升趨勢。表明黑木耳菌絲老化與其他植物等老化情況相似［14-15］，也存在著“自由基理論”。該研究結果發現，MDA、Pro含量呈下降趨勢，這與前人研究結果不同［13］。MDA是膜脂過氧化的產物之一［16］，Pro在一定程度上衡量膜穩定性［17］。該研究結果發現，MDA、Pro呈下降趨勢，這與前人研究結果不同［13］，其原因有待進一步分析。

通過進一步分析發現，抗氧化酶系統、MDA、Pro與胞外酶之間存在很高的相關性。表明抗氧化酶系統與胞外酶系統存在內容聯系，這部分未查到相關文獻，現有證據表明活性氧［18］、CAT［19］參與調節植物生長和發育。這可能是由于隨著培養時間延長，培養基中的活性氧、CAT等積累，從而影響到胞外酶的分泌；或者是由于隨著培養時間的延長，菌絲胞外酶難獲取更多的營養物質，從而導致抗氧化酶的功能啟動，這有待進一步進行研究。

參考文獻

［1］戴浩，何穎，杜順剛.對菌種市場存在問題的調查與建議［J］.中國食用菌，2010，29（1）：62-63.

［2］劉偉，何培新，蔡英麗，等.羊肚菌衰老特性的測定分析［J］.食藥用菌，2021，29（1）：44-49.

［3］袁立，許修宏.木耳菌絲老化過程的微形態學研究［J］.菌物學報，2011，30（4）：566-571.

［4］王博，許修宏，袁立.雙孢蘑菇營養菌絲老化現象的形態學研究［J］.東北農業大學學報，2011，42（5）：99-103.

［5］方亮.暗褐網柄牛肝菌菌絲體衰老相關生理特性及代謝組學分析［D］.南寧：廣西大學，2022.

［6］丁秋英.金福菇多糖抗衰老作用研究［D］.合肥：安徽大學，2016.

［7］李敏，閆偉.褐環乳牛肝菌在液體搖瓶培養過程中菌絲體活力指標的篩選研究［J］.華北農學報，2007，25（5）：176-179.

［8］許修宏，盛思遠，朱海峰，等.添加物對木耳液體菌種老化的影響［J］.東北農業大學學報，2019，50（9）：19-27.

［9］王云靈.雞腿菇菌種質量檢測技術研究［D］.福州：福建農林大學，2010.

［10］陳軍，王雨凈，夏志華.幾種珍稀食用菌菌種纖維素酶系組分活性的比較［J］.上海師范大學學報（自然科學版），2006，35（6）：76-80.

［11］IGHODARO O M，AKINLOYE O A.First line defence antioxidants.superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GPX）：Their fundamental role in the entire antioxidant defence grid［J］.Alex J Med，2017，54（4）：287-293.

［12］GILL S S，TUTEJA N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress? tolerance in crop plants［J］.Plant Physiol Biochem，2010，48（12）：909-930.

［13］朱海峰.黑木耳液體菌種老化評價指標的研究［D］.哈爾濱：東北農業大學，2021.

［14］韓沛霖，李月明，劉梓毫，等.植物種子老化的生理學研究進展［J］.生物工程學報，2022，38（1）：77-88.

［15］劉娟，歸靜，高偉，等.種子老化的生理生化與分子機理研究進展［J］.生態學報，2016，36（16）：4997-5006.

［16］趙娟，尹藝臻，王曉璐，等.不同品種谷子愈傷組織對拿捕凈脅迫的生理響應［J］.中國農業科學，2020，53（5）：917-928.

［17］徐亞軍，趙龍飛，邢鴻福，等.內生細菌對鹽脅迫下小麥幼苗脯氨酸和丙二醛的影響［J］.生態學報，2020，40（11）：3726-3737.

［18］龐杰，郝麗珍，張鳳蘭，等.沙芥葉片活性氧和抗壞血酸對干旱脅迫的響應［J］.植物生理學報，2013，49（1）：57-62.

［19］王麗寧.糙皮側耳過氧化氫酶基因特征分析和功能研究［D］.北京：中國農業科學院，2019.