可降解PLA/PBAT塑料的微生物菌群結構研究

裴雯玉 江雨韓 李娜 陳怡 吳弘

摘要? 為探究PLA/PBAT 復合材料在菌群處理下的降解情況，加快該塑料的生物降解速率。通過富集培養法篩選獲得不同批次的可降解菌群，基于失重法評估不同批次菌群對于PLA/PBAT 復合材料的降解能力，并利用高通量測序分析批次間微生物的結構特點。結果發現，通過多輪富集后，在相同的處理周期內，PLA/PBAT塑料的失重率由2.52%提高到4.93%。轉接多批次后在門分類水平上菌群豐度最高的 5 個菌門分別為擬桿菌門、浮霉菌門、變形菌門、裝甲菌門和綠彎菌門，占比超過95.00%；在屬水平上，豐度較高的分別為擬桿菌門OPB56屬和浮霉菌門SH-PL14屬。微生物群落結構隨著不斷的轉接而趨于穩定。

關鍵詞? PLA/PBAT塑料；失重率；高通量測序；菌群結構

中圖分類號? X172? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）04-0057-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.012

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Microbial Community Structure of Degradable PLA/PBAT Composites

PEI Wen.yu， JIANG Yu.han， LI Na et al

（College of? Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract? In order to explore the degradation of PLA/PBAT composites under the treatment of bacteria， we analyzed the characteristics of microbiome and accelerated the biodegradation rate.? In this study， different batches of bacteria were screened and their degradation ability were evaluated based on weightlessness method. The characteristics of microorganisms among different batches were analyzed by high.throughput sequencing. The results showed that the weight loss of PLA/PBAT plastics increased from 2.52% to 4.93%.The five highest abundance at phyla level were Bacteroidetes， Planctomycetes， Proteobacteria， Armatimonadetes and Chloroflexi， accounting for more than 95.00%. OPB56 and SH.PL14 were the highest abundance at genus level. The microbial community structure tended to be stable.

Key words? PLA/PBAT plastics;Weightlessness rate;High.throughput sequencing;Flora structure

基金項目? 天津市科學計劃項目（18ZLZXZF00220）；天津市級“大學生創新創業訓練計劃”（202210065167）；天津師范大學引進人才基金項目（5RL147）。

作者簡介? 裴雯玉（2000—），女，山西長治人，碩士研究生，研究方向：微生物篩選。*通信作者，講師，博士，從事微生物功能研究。

收稿日期? 2023-02-24；修回日期? 2023-03-30

近年來，可生物降解塑料在全球的需求激增，其不僅具備傳統塑料的優越性能，還具有良好的生物相容性和可降解性［1-2］，對于生態環境保護、經濟可持續發展具有重要的研究價值［3-4］。聚乳酸（PLA）和聚對苯二甲酸-己二酸-丁二酯（PBAT）混合后形成的PLA/PBAT共聚物是目前可生物降解塑料中研究較多的材料之一［5-6］。然而越來越多關于生物降解型塑料膜的研究發現，如果在環境中降解不完全，形成的微塑料會造成比普通塑料還要大的環境隱患［7-8］。因此，深入研究生物降解型塑料的降解機制，發掘更高效的生物降解系統顯得尤為迫切。

目前，科研工作者一直通過努力篩選高效塑料降解菌來實現完全的微生物降解。據報告，Jia等［9］從農田土壤中篩選分離了一種能夠降解PBAT的Stenotrophomonas sp.YCJ1，在pH 7.5時該菌的降解率最高，脂肪酶活性達到5.17 U/mL。Kasuya等［10］在自然條件下篩選了一株能夠單獨降解PBAT的真菌NKCM1712；Satti等［11］在30 ℃條件下篩選鑒定出3種菌株能高效降解PLA，包括Chryseobacterium sp.、Sphingobacterium sp.以及Pseudomonas aeruginosa。Urbanek等［12］從極端環境北極極地土壤樣品中分離篩選得到Rhodococcus sp.，可以降解包括PLA在內的生物可降解塑料。但是單株菌的作用始終有限，尚未取得理想的效果，因此，開發和利用混合微生物體系來消除培養后期次級代謝產物對單一菌株的限制，提高塑料的降解效率成為了研究的新方向和新熱點［13-14］。混菌體系降解塑料的研究也有報道，Jia等［15］開發了假單胞菌與秀麗放線菌的共培養體系，協同作用下實現了對PLA/PBAT復合材料薄膜的高效降解。Auta等［16］發現芽孢桿菌和紅球菌混合后對于聚乙烯的降解效果要比單獨菌株強。因此，進一步挖掘可以高效降解PLA/PBAT復合材料的菌株，研究其組成特點和協同作用的關系，對于提高環境中塑料的降解效率具有重要意義［17-19］。

該研究從塑料污染嚴重地區采集土壤樣品，利用選擇性培養基篩選并富集PLA/PBAT塑料膜高效降解菌群，對塑料膜降解過程中各代菌群結構的動態演替規律進行了分析和對比研究，探索可降解PLA/PBAT塑料的核心微生物物種。以期為降解菌群的富集條件優化和降解微生物特性研究奠定基礎，提高PLA/PBAT復合材料的生物降解效率。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料和土壤樣品

PLA/PBAT復合塑料膜采購自東莞市三燕塑膠原料有限公司。該研究所使用的土壤樣品采集自湖南省衡陽市垃圾場附近。選擇垃圾沉積時間較長的區域，基于五點取樣法，將收集的土壤樣品貯存于滅菌的透明封口袋內并編號，迅速帶回實驗室進行后續處理。

1.2? 培養基

1.2.1

Luria-Bertani（LB）培養基。蛋白胨10.00 g/L，酵母提取物5.00 g/L，氯化鈉19.00 g/L，氫氧化鈉溶液調節pH至7.4。121 ℃滅菌 20 min。

1.2.2

無機鹽培養基。K2HPO4 0.700 g/L、KH2PO4 0.700 g/L、MgSO4·7H2O 0.700 g/L、NH4NO3 1.000 g/L、NaCl 0.005 g/L、FeSO4·7H2O 0.002 g/L、ZnSO4·7H2O 0.002 g/L、MnSO4·H2O 0.001 g/L，調節pH至7.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.3? 降解菌群的篩選和轉接富集

首先將PLA/PBAT復合塑料膜制備成大小規格為 10 mm×10 mm 的薄片，在 2% SDS 中浸泡過夜，隨后在75%酒精中浸泡4 h，用無菌水沖洗干凈備用。稱取10 g土樣于90 mL無菌水中，制得土壤稀釋液。放置3片PLA/PBAT薄膜到180 mL無機鹽培養基中，制備成以PLA/PBAT復合塑料膜為唯一碳源的培養環境，然后按照10%的接種量取20 mL土壤稀釋液到培養基中，在37 ℃搖床中連續培養22 d（該試驗以22 d為一個降解周期），觀測PLA/PBAT塑料膜在液體培養基中的崩解情況。選擇未添加土壤稀釋液的PLA/PBAT塑料膜-無機鹽液體培養基作為空白對照組。

第一個降解周期培養結束后，繼續富集轉接時，將 10%（20 mL）的培養液轉接入新的PLA/PBAT復合塑料膜-無機鹽液體培養基中，37 ℃培養22 d，共轉接3次，得到3個批次培養液（初始菌液記為G0，第1次轉接后的菌液記為G1，第2次和第3次轉接后的菌液分別記為G2和G3）。

1.4? PLA/PBAT塑料膜失重率

一個降解周期培養結束之后，在超凈臺中將三角搖瓶打開，將PLA/PBAT復合塑料膜用75％的酒精和無菌水沖洗2遍。晾干之后測定降解后的PLA/PBAT塑料膜質量，并計算失重率。

失重率（%）=PLA/PBAT塑料膜純損失質量/培養前塑料膜質量×100

通過搖瓶培養前后塑料膜重量的變化來計算失重率，失重率越高，則說明塑料膜的降解效果越好。

1.5? DNA提取和高通量測序

取每個批次（G0、G1、G2和G3共計4個批次）的菌體進行收集，用細菌全基因組提取試劑盒（TIANGEN，中國）完成菌群 DNA的抽提，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后將樣本送至上海美吉生物有限公司開展高通量測序。

選取細菌 16S rRNA 的 V4～V5 區進行高通量測序分析。首先利用通用引物 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′進行PCR 擴增，擴增回收后在 Illumina HiSeq 2500測序平臺上完成高通量測序分析。然后對測得的原始數據進行處理，包括拼接、質控、抽平等，獲得的序列以 97%相似性生成 OTU（operational taxonomic units），再使用Silva 128 數據庫比對，得到物種信息注釋的基本情況。

1.6? 生物信息學統計分析

采用 UPARSE 軟件進行 OTU 聚類后，將微生物在門、綱、目、科、屬、種分類水平上進行群落結構的統計分析，利用 R 語言（Version 3.4.1）進行統計學分析，計算細菌群落的 α-多樣性指數，包括Observed OUT 和 Shannon指數等，并基于加權和非加權分析不同批次細菌群落的 β-多樣性指數。

2? 結果與分析

2.1? PLA/PBAT塑料膜高效降解菌群的富集和篩選

該研究共采集35份土壤樣本，將土壤稀釋液接種于PLA/PBAT復合塑料膜-無機鹽液體培養基中進行富集培養。37 ℃培養22 d后，發現其中1個搖瓶出現PLA/PBAT塑料膜破碎的現象，說明該土壤樣本中具備能夠降解PLA/PBAT塑料膜的微生物菌群，將其作為初始的研究菌群，記為G0。隨后將G0接種至新的PLA/PBAT復合塑料膜-無機鹽液體培養基，轉接后獲得第一批次（記為G1），第2批次（記為G2）和第3批次（記為G3）的菌液。

在培養過程中定期觀察降解膜的狀態，結果顯示，在未進行任何處理的情況下，PLA/PBAT塑料膜表面較為平整，有韌性。而第1次轉接菌液培養22 d，PLA/PBAT塑料韌性逐漸消失，易于破碎；經過第2批次菌液處理后可觀察到塑料4周發生破損，表面有裂紋；直到在第3批次G3菌群的處理下，可以明顯發現PLA/PBAT塑料發生完全崩解破碎（圖1）。由此可見，菌群降解能力隨著富集代數的增加而增強。

檢測塑料膜的失重率，結果發現，G0菌群在22 d后塑料膜的失重率為 2.52%，而到了第3批次G3，轉接處理同樣的天數，塑料失重率高達 4.93%（圖1），說明G3批次的微生物降解PLA/PBAT塑料的效果越好。

2.2? 轉接富集中高效降解菌群的結構變化

將G0、G1、G2、G3的菌液提取DNA后進行建庫測序分析，結合16S rRNA高通量測序的結果，分析G0、G1、G2、G3的微生物群落結構。利用韋恩分析發現，各組共有的OTU個數為75，而特有的OTU在不同批次的微生物中差異較大，G0、G1、G2、G3各自特有的數目為167、83、21、17（圖2）。 隨著轉接次數的增加，菌群中特有的OTU數目呈現出減少的趨勢。

分析各個批次菌群的結構組成，結果顯示：門水平上，G0

中的優勢菌依次是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門

（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），相對豐度分別為50.15%、9.50%、 6.57%、6.38%、5.75%和

5.37%，所占比例高達83.00%以上。隨著連續轉接富集到G3，其優勢菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）和綠彎菌門（Chloroflexi），相對豐度分別為 39.57%、20.10%、15.55%、10.40%和 9.73%，這5個優勢菌門所占比例達到95.00%以上，遠遠高于其他門水平（圖3）。

因此，在逐代轉接的過程中，變形菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）、酸桿菌門（Acidobacteria）的占比隨著轉接次數的增加而減少；而擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、裝甲菌門（Armatimonadetes）則隨著轉接次數的增加而增加，說明這4個門的菌株能夠適應逐代的降解過程，并且發揮出良好的降解性能，尤其是浮霉菌門（Planctomycetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。

根據門分類水平上群落組成結構結果分析可知，擬桿菌門為PLA/PBAT塑料降解的優勢菌門，這與他人對塑料降解菌群的研究一致，擬桿菌門的細菌是多糖的主要降解者［20-21］。孫超岷等［20］研究發現，深海冷泉擬桿菌可通過降解藻類多糖促進深海營養和碳循環，并通過轉錄組學和代謝組學聯合分析了該菌株的降解和利用機制。在擬桿菌門的研究中，其編碼碳水化合物酶的基因數量明顯高于變形菌門和綠彎菌門中的細菌［21］。

從屬水平對不同轉接代次的微生物群落結構進行分析，比較菌群結構組成可以發現，不同轉接批次的微生物群落相對豐度不同，存在一定的差異。從G0到G3，其微生物在屬水平上差異較大，擬桿菌門OPB56屬、綠彎菌門厭氧繩菌屬、浮霉菌門SH-PL14所占比例隨著轉接富集的次數增加而明顯升高，分別由6.57%升至39.57%、由3.43%升至9.73%和由6.38%升至20.10%（圖4）。該結果說明這3個菌屬在富集轉接的過程中適應了以PLA/PBAT塑料膜為唯一碳源的培養條件，并逐漸成為降解PLA/PBAT塑料膜的優勢菌群，后續將會繼續深入研究這3個菌屬的基因組特點。擬桿菌門OPB56屬在轉接富集過程相對豐度逐漸升高，比較G0和G3可以發現其占比具有顯著性差異。這和之前研究發現擬桿菌門可能是降解PLA/PBAT塑料的潛在細菌類型是一致的。至于其具體的降解機制，還需要結合宏基因組學、代謝組學等多手段進行深入的研究，發掘可能的降解基因或者降解機制。

2.3? PLA/PBAT塑料地膜高效降解菌群轉接富集結果

為了更進一步發掘微生物降解PLA/PBAT塑料膜的機制，使用 Mothur 軟件計算不同批次PLA/PBAT塑料膜降解菌群的特點，開展阿爾法和貝塔多樣性分析，各樣品細菌群落的 α-多樣性指數見表1。在Shannon指數和Chao指數的比較中，可以發現G0和G3存在顯著差異。經過多次轉接后，菌群的豐富度和多樣性都降低了，整個菌群結構趨于單一化，這是微生物適應PLA/PBAT復合材料為唯一碳源的調整。

同時，對不同批次的微生物菌液進行基于 Bray-Curtis距離的主坐標分析（PCoA），結果見圖 5。從圖5可以看出，基于 unweighted Unifrac 距離的 PCoA 分析中，第一主坐標軸的解釋度為54.06%，第二主坐標軸的解釋度為 25.21%；而基于 weighted Unifrac 距離的 PCoA 分析中，第一主坐標軸的解釋度為 67.21%，第二主坐標軸的解釋度為 20.09%。無論采用加權還是非加權的算法，4個批次的樣品分為明顯的4個區域，這表明不同批次間的微生物群落構成具有較大差異。

2.4 ?不同代次之間的微生物關系分析

每個門的代表屬基本符合各門的數量變化規律，只有個別代表屬的數量變化規律不符合所屬門的變化規律。數量變化較為明顯的10個屬中，MND1、Aquicella、Subgroup_6_unclassified、Pedosphaeraceae_unclassified 4個屬的數量隨著轉接次數的增加而減少，說明該4個屬不適應膜降解的環境；而Fimbriimonadaceae_unclassified、OPB56_unclassified、Anaerolineaceae_unclassified、OLB13、SH-PL14、Armatimonadetes_unclassified 6個屬的數量隨著轉接次數的增加而增加，說明該6個屬適應了降解PLA/PBAT塑料膜的環境（圖6）。占比較大的擬桿菌門（Bacteroidetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）所對應的OPB56_unclassified和SH-PL14也是占比較大的屬。同時，其他菌屬的占比隨著轉接代數的增加而減少，說明了菌群結構的集中化。

3? 結論和討論

PLA/PBAT復合塑料是一種環境友好型材料，但是目前的研究表明其在短期或中期很難實現土壤中的完全降解。為了提升其生物處理的速度，開發高效的降解體系以及探究降解的機制顯得尤為重要［22-23］。

該研究通過篩選土壤中具備降解能力的微生物菌群，并通過多代富集來分析塑料降解微生物的組成特點以及降解機制，結果發現：①通過多輪富集后，微生物降解PLA/PBAT復合塑料的效率提高了，22 d的降解周期內，失重率由252%提高到4.93%；②通過高通量測序分析不同轉接代次微生物的結構組成，隨著轉接次數的增加，優勢菌株的占比增大，特有菌屬的數量在降低；③在門分類水平上，轉接富集多次后（G3）的菌群豐度較高的 5 個菌門分別為擬桿菌門、浮霉菌門、變形菌門、裝甲菌門和綠彎菌門，占比超過95.00%；在屬分類水平上，豐度較高的菌屬分別為擬桿菌門OPB56屬和浮霉菌門SH-PL14。

該研究利用高通量測序對從垃圾廠附近采集的土壤進行了多輪富集培養，獲得了一個能夠高效降解PLA/PBAT復合塑料的菌群，并通過分析微生物的組成發現群落結構隨著不斷的轉接而趨于穩定，優勢菌屬的特征明顯。在富集培養初期，由于群落需要一定的適應性，因而菌群群落結構變化較大，而隨著轉接的次數增加，能夠降解PLA/PBAT復合塑料的菌群逐漸成為優勢菌屬，這些都是潛在的塑料降解菌，其降解機制還需要進一步探究。

下一步要繼續研究不同種微生物的共培養體系，提高PLA/PBAT塑料的降解率。

參考文獻

［1］林世東，杜國強，顧君，等.我國生物基及可降解塑料發展研究［J］.塑料工業，2021，49（3）：10-12，37.

［2］薛溪睿.可降解塑料發展現狀及未來展望［J］.山東化工，2022，51（16）：100-103.

［3］扈瀚文，楊萍萍，薛含含，等.環境微塑料污染的研究進展［J］.合成材料老化與應用，2020，49（1）：97-102.

［4］ZHANG K，HAMIDIAN A H，TUBIC＇ A，et al.Understanding plastic degradation and microplastic formation in the environment：A review［J］.Environmental pollution，2021，274：1-14.

［5］QIU S，ZHOU Y K，WATERHOUSE G I N，et al.Optimizing interfacial adhesion in PBAT/PLA nanocomposite for biodegradable packaging films［J］.Food chemistry，2021，334：1-9.

［6］張云飛，黃安平，張文學，等.PLA/PBAT復合材料研究進展［J］.工程塑料應用，2019，47（1）：154-158.

［7］湯慶峰，高峽，李琴梅，等.農田土壤微塑料污染研究現狀與問題思考［J］.安徽農業科學，2021，49（15）：72-78，84.

［8］QI Y L，YANG X M，PELAEZ A M，et al.Macro.and micro.plastics in soil.plant system：Effects of plastic mulch film residues on wheat（Triticum aestivum）growth［J］.The science of the total environment，2018，645：1048-1056.

［9］JIA H，ZHANG M，WENG Y X，et al.Degradation of poly（butylene adipate.co.terephthalate）by Stenotrophomonas sp.YCJ1 isolated from farmland soil［J］.Journal of environmental sciences，2021，103：50-58.

［10］KASUYA? K I，ISHII N，INOUE Y， et al.Characterization of a mesophilic aliphatic.aromatic copolyester.degrading fungus［J］.Polymer degradation and stability，2009，94（8）：1190-1196.

［11］SATTI S M，SHAH A A，AURAS R，et al.Isolation and characterization of bacteria capable of degrading poly（lactic acid）at ambient temperature［J］.Polymer degradation and stability，2017，144：392-400.

［12］URBANEK A K，RYMOWICZ W，STRZELECKI M C，et al.Isolation and characterization of Arctic microorganisms decomposing bioplastics［J］.AMB express，2017，7（1）：1-10.

［13］YUAN J H，MA J，SUN Y R，et al.Microbial degradation and other environmental aspects of microplastics/plastics［J］.Science of the total environment，2020，715：1-9.

［14］ER J，STLOUKAL P，JANOV P，et al.Accelerated biodegradation of agriculture film based on aromatic.aliphatic copolyester in soil under mesophilic conditions［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2016，64（28）：5653-5661.

［15］JIA H，ZHANG M，WENG Y X，et al.Degradation of polylactic acid/polybutylene adipate.co.terephthalate by coculture of Pseudomonas mendocina and Actinomucor elegans［J］.Journal of hazardous materials，2021，403：1-7.

［16］AUTA H S，EMENIKE C U，FAUZIAH S H.Screening of Bacillus strains isolated from mangrove ecosystems in Peninsular Malaysia for microplastic degradation［J］.Environmental pollution，2017，231：1552-1559.

［17］徐松，王敬敬，周婷婷，等.聚己二酸/對苯二甲酸丁二酯塑料地膜高效降解菌群篩選及其群落結構演替特征［J］.微生物學通報，2018，45（11）：2341-2352.

［18］許楹，殷超凡，岳紋龍，等.石油基塑料的微生物降解［J］.生物工程學報，2019，35（11）：2092-2103.

［19］MORRO A，CATALINA F，SANCHEZ.LEN E，et al.Photodegradation and biodegradation under thermophile conditions of mulching films based on poly（butylene adipate.co.terephthalate）and its blend with poly（lactic acid）［J］.Journal of polymers and the environment，2019，27（2）：352-363.

［20］LI H Y，CAO W X，XIE J W，et al.α.D.1，6.glucan from Castanea mollissima Blume alleviates dextran sulfate sodium.induced colitis in vivo［J］.Carbohydrate polymers，2022，289：1-12.

［21］LAPBIE P，LOMBARD V，DRULA E，et al.Bacteroidetes use thousands of enzyme combinations to break down glycans［J］.Nature communications，2019，10（1）：1-7.

［22］苗開珍，孟嬌龍，姜雪峰.塑料廢棄物污染及降解的研究進展［J］.華東師范大學學報（自然科學版），2023（1）：170-176.

［23］俞學如，陳森，梁思嘉，等.可降解塑料的使用現狀及其潛在環境風險［J］.環境化學，2023，42（1）：29-40.