滯育時間對豆天蛾幼蟲營養成分及代謝酶活性的影響

錢 蕾, 秦 毅, 張 佳, 李宗男, 鄧 盼, 周 剛, 李情怡, 廖懷建,

(1.江蘇省農業科學院休閑農業研究所,江蘇 南京 210014; 2.揚州大學植物保護學院,江蘇 揚州 225009; 3.淮安市農業科學院,徐淮地區淮陰農業科學研究所,江蘇 淮安 223001; 4.江蘇科技大學生物技術學院,江蘇 鎮江 212100)

豆天蛾(Clanisbilineatatsingtauica)屬鱗翅目(Lepidoptera)天蛾科(Sphingidae)[1],是一種具有極高營養價值、藥用價值和經濟價值的食用昆蟲[2-4]。豆天蛾幼蟲富含蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素等營養物質,食用豆天蛾幼蟲有助于促進人體大腦發育、減緩細胞衰退、保持機體內分泌平衡等[5-7]。目前,人工養殖豆天蛾幼蟲已經成為中國農村的特色農業產業,特別是在江蘇省連云港市灌云縣、淮安市漣水縣等地,豆天蛾幼蟲年產量達30 000 t,年產值近4.5×109元[8]。豆天蛾江蘇種群1年發生1代,每年9月豆天蛾以老熟幼蟲入土越冬,進入滯育狀態,直至第二年6月中旬化蛹、羽化[8-9]。滯育是昆蟲響應不良環境的一種生存適應策略。進入滯育狀態的昆蟲一般通過調控體內營養物質(主要包括脂類、氨基酸和碳水化合物等)的含量和種類應對低溫、食物匱乏等逆境[10-11]。有研究結果表明,昆蟲體內營養物質含量隨滯育時間的延長而變化,如滯育期開心果殼螟(Arimaniacomaroffi)體內脂肪含量以及煙蚜繭蜂(Aphidiusgifuensis)體內甘油和海藻糖的含量均隨著滯育時間的延長呈倒U型變化,而煙蚜繭蜂的糖原含量在滯育期呈線性下降[12-13]。除了貯存營養物質外,昆蟲還通過降低代謝保障滯育期間的能量需求和滯育解除后生長發育所需的能量[14-16],如蘋果實蠅(Rhagoletispomonella)在滯育期間會抑制呼吸速率和代謝速率,減少營養物質消耗[17],而滯育期豆天蛾幼蟲的營養代謝機制尚不清楚。

目前,已有關于豆天蛾滯育的研究主要集中在溫度、光周期條件對滯育幼蟲生物學特性的影響或者滯育幼蟲體內瞬時的營養成分變化,關于整個滯育周期內豆天蛾幼蟲內源營養物質及代謝酶動態變化的研究較少。因此,本研究擬以滯育期豆天蛾幼蟲為研究對象,對滯育過程中老熟幼蟲體內營養物質的含量進行檢測,分析腸道代謝酶活性的變化趨勢,以期為闡明豆天蛾滯育期間對營養物質的調控機理奠定理論基礎,為豆天蛾幼蟲綠色、高效繁育提供科技指導。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

2022年9月于江蘇省農墾農業發展股份有限公司云臺分公司豆丹養殖基地(119.29°E,34.59°N)采集了同一批大小一致的豆天蛾老熟幼蟲,帶回室內養蟲室進行觀察,作為試驗蟲源。條件設置為:溫度(15±1) ℃,相對濕度70%±5%,光周期14 h(光照時間)∶10 h(黑暗時間)。

1.2 試驗設計

待豆天蛾老熟幼蟲入土做蟲室,并且保持靜止狀態時,即認定其進入滯育期。采集即將有入土行為的老熟幼蟲作為對照(滯育前);分別取滯育時間為30 d、60 d、90 d、120 d、150 d的豆天蛾幼蟲為處理組。分別采集對照和處理組的豆天蛾幼蟲,用去離子水洗凈后放入50.0 ml離心管中,放入液氮中速凍,冷凍保存于-80 ℃超低溫冰箱(DW-86L388J,購自青島海爾生物醫療股份有限公司),用于豆天蛾幼蟲體內蛋白質、氨基酸、脂肪酸含量的測定,3頭幼蟲為1個樣本,每組重復5次。解剖豆天蛾幼蟲取其中腸組織,放入1.5 ml離心管中,液氮速凍,冷凍保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于測定幼蟲腸道代謝酶(包括海藻糖酶、堿性磷酸酶、己糖激酶、丙酮酸激酶和山梨醇脫氫酶)活性,10頭幼蟲的腸組織為1個樣本,每組重復5次。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 豆天蛾幼蟲體內營養物質含量的測定 采用凱氏定氮法測定豆天蛾幼蟲體內蛋白質的含量。稱取0.2 g樣品于消化管中,加入0.4 g硫酸銅、6.0 g硫酸鉀及20 ml硫酸于消化爐中進行消化,當消化爐溫度達到420 ℃之后,繼續消化1 h,消化管中的液體呈藍綠色并澄清透明后,取出冷卻,然后加入20 ml水,放冷,于自動凱氏定氮儀(K9840,購自濟南海能儀器股份有限公司)中蒸餾7 min,于接收瓶中加指示劑混合溶液1～2滴和10 ml硼酸溶液(20 g/L),接收蒸餾液到200 ml,然后用鹽酸標準溶液(0.100 mol/L)滴定,終點為淺灰紅色,同時做試劑空白。根據公式計算豆天蛾幼蟲體內蛋白質的含量,換算系數為6.25。

通過氨基酸自動分析儀(LA8080;購自日立公司)測定豆天蛾幼蟲體內17種氨基酸[天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)、蘇氨酸(Threonine,Thr)、絲氨酸(Serine,Ser)、谷氨酸(Glutamic acid,Glu)、甘氨酸(Glycine,Gly)、丙氨酸(Alanine,Ala)、半胱氨酸(Cysteine,Cys)、纈氨酸(Valine,Val)、蛋氨酸(Methionine,Met)、異亮氨酸(Isoleucine,Ile)、亮氨酸(Leucine,Leu)、酪氨酸(Tyrosine,Tyr)、苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)、賴氨酸(Lysine,Lys)、組氨酸(Histidine,His)、精氨酸(Arginine,Arg)、脯氨酸(Proline,Pro)]的含量。采用高效液相色譜法(HPLC)測定幼蟲體內色氨酸(Tryptophan,Trp)的含量。色譜柱是Agilent C18(4.6 mm×150.0 mm×5.0 μm),柱溫設為35 ℃,進樣量為10.0 μl,流速為1.2 ml/min,波長為280 nm。

采用氣相色譜-質譜聯用儀測定豆天蛾幼蟲體內脂肪酸的含量。色譜柱為HP-88 Agilent(100.00 m×0.25 mm×0.20 μm),進樣溫度設為290.0 ℃,載氣He,流速1.0 ml/min,不分流。質譜條件設為:離子源溫度280.0 ℃,傳輸線溫度280.0 ℃,溶劑延遲5 min,掃描范圍30～400 U,離子源為EI源,電子能量70 eV。升溫程序:初始溫度100.0 ℃保持13 min,以10.0 ℃/min的速率升溫至180.0 ℃,保持6 min,以1.5 ℃/min的速率升溫至192.0 ℃,保持6 min,再以3.5 ℃/min的速率升溫至240.0 ℃保持4 min。

1.3.2 豆天蛾幼蟲腸道代謝酶活性的測定 按照青島科創質量檢測有限公司試劑盒的說明書,測定不同滯育時間豆天蛾幼蟲腸道代謝酶(包括海藻糖酶、堿性磷酸酶、己糖激酶、丙酮酸激酶和山梨醇脫氫酶)的活性變化。

1.4 數據計算與分析

按公式(1)計算蛋白質含量:

蛋白質含量(%)=[(試樣消耗鹽酸量-空白消耗鹽酸量)×0.100×0.010]/(樣品量×消化液體積/100)×6.250×100×100%

試驗數據均采用Microsoft Excel 2016進行整理,利用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進行統計分析,用GraphPad Prism8.3.0軟件作圖。應用單因素方差分析明確不同滯育時間對豆天蛾幼蟲體內蛋白質、氨基酸、脂肪酸含量以及腸道代謝酶活性的影響。采用Tukey檢驗法分析不同滯育時間處理之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 滯育時間對豆天蛾幼蟲體內蛋白質含量的影響

圖1顯示,與對照相比,滯育期豆天蛾幼蟲體內蛋白質含量均顯著提高(P<0.05);隨著滯育時間的延長,滯育150 d(滯育后期)的豆天蛾幼蟲體內蛋白質含量高達21.03%,與滯育30 d、60 d、90 d、120 d的豆天蛾幼蟲體內蛋白質含量相比,分別提高了4.16個百分點、3.40個百分點、2.60個百分點、3.96個百分點。

圖中不同小寫字母表示不同滯育時間的豆天蛾幼蟲體內蛋白質含量差異顯著(P<0.05)。

2.2 滯育時間對豆天蛾幼蟲體內氨基酸含量的影響

本研究測定了滯育期豆天蛾幼蟲體內18種氨基酸含量的變化,結果(表1)表明,滯育后期(150 d)豆天蛾幼蟲體內18種氨基酸含量均顯著高于對照(P<0.05)。滯育期豆天蛾幼蟲體內蘇氨酸(Thr)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和賴氨酸(Lys)這5種必需氨基酸的含量均顯著高于對照(P<0.05);滯育90 d、120 d、150 d豆天蛾幼蟲體內色氨酸(Trp)含量分別比對照高0.06個百分點、0.06個百分點、0.07個百分點(P<0.05)。豆天蛾第一限制氨基酸[蘇氨酸(Thr)]含量在滯育后期(150 d)達到最高值,為0.60%,比滯育30 d、60 d、90 d、120 d分別高0.12個百分點、0.14個百分點、0.04個百分點、0.09個百分點。

表1 滯育時間對豆天蛾幼蟲體內氨基酸含量的影響

2.3 滯育時間對豆天蛾幼蟲體內脂肪酸含量的影響

滯育期的豆天蛾幼蟲體內共檢測到6種脂肪酸,分別是棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸,其中亞油酸和亞麻酸是人體必需脂肪酸。表2顯示,與對照相比,滯育60 d豆天蛾幼蟲體內亞油酸含量顯著降低0.030個百分點(P<0.05),滯育30 d、90 d、120 d、150 d亞油酸含量變化不顯著。滯育30 d、90 d、120 d、150 d豆天蛾幼蟲體內亞麻酸含量分別高于對照0.140個百分點、0.060個百分點、0.060個百分點、0.080個百分點(P<0.05)。

表2 滯育時間對豆天蛾幼蟲體內脂肪酸含量的影響

2.4 滯育時間對豆天蛾幼蟲腸道代謝酶活性的影響

2.4.1 海藻糖酶活性 圖2顯示,隨著滯育時間的延長,豆天蛾幼蟲腸道海藻糖酶活性表現出先緩慢升高后降低再升高的趨勢。滯育90 d豆天蛾幼蟲腸道海藻糖酶活性高達35.46 U/g,顯著高于對照(P<0.05);滯育120 d豆天蛾幼蟲腸道海藻糖酶活性最低,為28.74 U/g,顯著低于對照(P<0.05)。與對照相比,滯育60 d、150 d豆天蛾幼蟲腸道海藻糖酶活性顯著升高,分別提高10.29%、9.39%(P<0.05)。

圖2 滯育時間對豆天蛾幼蟲腸道海藻糖酶活性的影響

2.4.2 堿性磷酸酶活性 圖3顯示,滯育120 d豆天蛾幼蟲腸道堿性磷酸酶活性高達40.54 U/g,與對照相比,顯著提高7.47%(P<0.05),且分別比滯育30 d、60 d、90 d、150 d豆天蛾幼蟲腸道堿性磷酸酶活性顯著提高14.26%、8.34%、14.22%、11.14%(P<0.05)。與對照相比,滯育30 d、90 d豆天蛾幼蟲腸道堿性磷酸酶活性顯著降低5.95%、5.91%(P<0.05)。

圖3 滯育時間對豆天蛾幼蟲腸道堿性磷酸酶活性的影響

2.4.3 己糖激酶活性 圖4顯示,隨著滯育時間的延長,豆天蛾幼蟲腸道己糖激酶活性表現出先降低后升高再降低的趨勢。滯育30 d豆天蛾幼蟲腸道己糖激酶活性最低,為15.07 U/g,比對照低4.76%(P<0.05),且分別比滯育60 d、90 d、120 d、150 d低8.33%、12.52%、18.80%、13.54%(P<0.05)。滯育120 d豆天蛾幼蟲腸道己糖激酶活性高達18.56 U/g,比對照高17.30%(P<0.05)。

圖4 滯育時間對豆天蛾幼蟲腸道己糖激酶活性的影響

2.4.4 丙酮酸激酶活性 圖5顯示,隨著滯育時間的延長,滯育90 d豆天蛾幼蟲腸道丙酮酸激酶活性達到最高,為8.90 U/g,與對照相比,顯著提高11.16%(P<0.05),且比滯育30 d、60 d、120 d顯著提高8.01%、23.44%、12.47%(P<0.05)。滯育60 d豆天蛾幼蟲腸道丙酮酸激酶活性最低,為7.21 U/g,與對照相比,顯著降低9.95%(P<0.05)。

圖5 滯育時間對豆天蛾幼蟲腸道丙酮酸激酶活性的影響

2.4.5 山梨醇脫氫酶活性 圖6顯示,隨著滯育時間的延長,滯育120 d豆天蛾幼蟲腸道山梨醇脫氫酶活性達到最高,為4.21 U/g,與對照相比,顯著提高18.37%,且比滯育30 d、60 d、90 d、150 d提高22.50%、12.27%、23.58%、22.86%(P<0.05)。滯育60 d山梨醇脫氫酶活性為3.75 U/g,與對照、滯育30 d、90 d、150 d相比,顯著提高5.34%、9.01%、9.97%、9.33%(P<0.05)。

圖6 滯育時間對豆天蛾幼蟲腸道山梨醇脫氫酶活性的影響

3 討 論

滯育期昆蟲體內的營養物質含量隨著滯育時間的延長而波動,以應對不同滯育階段的能量需求,維持滯育期間的代謝[18-19]。滯育期間昆蟲血淋巴中的氨基酸既可以作為代謝的中間產物,用于合成代謝與分解代謝,又可調節昆蟲血淋巴滲透壓,提高昆蟲抗寒性[20-22]。本研究發現,與對照相比,滯育期的豆天蛾幼蟲體內蛋白質含量顯著升高,滯育后期(150 d)18種氨基酸的含量均顯著高于對照。推測這是因為昆蟲通過積累滯育關聯蛋白質來儲存氨基酸,這些蛋白質在滯育前開始積累,并在滯育期間持續合成[10,18]。西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)等昆蟲滯育期間也表現為增加體內游離氨基酸含量和積累特定的蛋白質[10]。然而前人也有不同的發現,中紅側溝繭蜂(Microplitismediator)滯育過程中蛋白質的含量變化平緩,無顯著差異[23],可能是因為滯育期能量需求與合成代謝的不同造成昆蟲體內生理響應程度的差異[17]。筆者前期研究短期滯育的豆天蛾時也發現,滯育28 d豆天蛾幼蟲體內粗蛋白含量變化不顯著[24],這可能是因為滯育前期營養物質還在積累中,蛋白質變化還未達到顯著水平。

脂肪酸不僅是滯育昆蟲儲存的營養物質,還是其低溫下的抗凍保護劑,可以保障生物膜的正常功能[25-28]。郭明明等[29]研究滯育期豆天蛾幼蟲營養物質瞬時變化規律時發現,滯育期豆天蛾幼蟲必需脂肪酸亞麻酸的含量明顯低于未滯育幼蟲與滯育解除后的幼蟲。而本研究分析整個滯育期豆天蛾幼蟲脂肪酸含量動態變化時發現,幼蟲體內亞麻酸的含量在滯育初期急劇增加,并在滯育30 d達到最高。推測可能是豆天蛾幼蟲響應滯育初期的營養代謝反應更強烈,當滯育狀態逐漸穩定時,幼蟲體內代謝活動也越穩定。筆者前期研究也發現,滯育28 d豆天蛾幼蟲體內亞麻酸含量明顯升高,與本研究的結果一致[24]。

酶活性的穩定對生物代謝有至關重要的作用,酶活性越穩定,生物代謝就越穩定,生物適應能力就越強[30-32]。本研究分析了滯育時間對豆天蛾幼蟲腸道代謝酶活性的影響,發現滯育中期(90 d)豆天蛾幼蟲腸道海藻糖酶活性達到最高,但在滯育120 d、150 d波動較大。有研究發現,桃小食心蟲、梨小食心蟲、家蠶體內海藻糖酶活性隨滯育時間的延長而逐漸降低,從而使海藻糖含量維持在較高水平,提高蟲體抗逆能力[15,20]。豆天蛾幼蟲腸道堿性磷酸酶活性在滯育120 d達到最高,并在滯育后期迅速降低,可能是因為堿性磷酸酶對昆蟲滯育時間有一定的調控作用[33]。己糖激酶是糖酵解途徑的關鍵酶。滯育前期(30 d)豆天蛾幼蟲腸道己糖激酶的活性降低,說明此時豆天蛾幼蟲腸道糖酵解較少;滯育30～120 d己糖激酶活性逐漸升高,說明糖原酵解正在加強,豆天蛾幼蟲在滯育期間不斷積累糖原,為其生命活動提供能量,這一結果與張順益等[33]、王鵬等[34]的研究結果一致。豆天蛾幼蟲腸道山梨醇脫氫酶活性在滯育120 d達到最高,并在滯育150 d迅速降低,說明豆天蛾幼蟲在滯育后期代謝活動逐漸減弱,降低體內營養物質消耗,從而順利度過嚴寒季節[35]。

本研究結果表明,豆天蛾幼蟲通過調控體內關鍵代謝酶的活性,使其在滯育期間的營養物質和能量代謝得到調節,提高蟲體抵御外界不良環境條件的能力,從而順利越冬。另外,腸道微生物能夠通過調節宿主關鍵酶的活性進而影響昆蟲營養物質的合成[36]。未來可結合微生物學與代謝組學對豆天蛾幼蟲滯育期間關鍵酶、基因的作用進行聯合分析,研究腸道細菌通過代謝酶對宿主營養合成與代謝的調控機制。本研究結果可以為下一步研究溫度、光周期調控豆天蛾幼蟲滯育機制奠定理論基礎,為豆天蛾產業打破幼蟲冬季滯育提供技術支撐,從而提高豆天蛾的年產量;還可以為豆天蛾營養物質的開發與利用提供技術指導,有利于提高產品的附加值,最終為豆天蛾產業結構的優化升級提供科學依據。