水飛薊素抑制鼻咽癌模型大鼠鼻黏膜組織炎癥及損傷

徐輝聰 鐘零珠 梁衛勤 王少軍 （海口市第三人民醫院耳鼻咽喉科，海口 571100）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部的頭頸部惡性腫瘤，其臨床癥狀主要表現為鼻塞、涕中帶血、耳悶、聽力下降以及頭痛等，因其臨床癥狀不典型，發現時常已進展至中晚期［1］。目前，手術切除及放化療可有效延長NPC患者的生存時間，但易造成放射性鼻竇炎等不良反應，從而影響NPC患者預后［2］。既往研究表明，NPC與EB病毒感染、遺傳、環境等因素均密切相關，NPC發生過程中通常伴隨炎癥反應［3］。IL-6是存在于黏膜固有層的一種重要促炎因子，在炎癥的發生發展中發揮關鍵作用［4］。信號傳導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是IL-6信號通路的關鍵下游調節因子，可持續激活炎癥反應并誘導細胞癌變［5-6］。

中藥因其安全、不良反應小等優點，在臨床防治NPC上可能具有良好的前景，既往研究通過體內外實驗證實中藥對NPC的治療效果顯著［7］。水飛薊素（Silymarin，SIL）是從菊科植物水飛薊種子或果實中提取出的一種黃酮木質素類化合物，具有消炎、抗氧化、調節免疫以及抗腫瘤等作用［8］。研究顯示，SIL與臨床上一些常規化療藥物具有一定的協同作用，在臨床上能夠有效發揮抗腫瘤作用［9］。本研究通過建立NPC大鼠模型，觀察SIL對NPC大鼠鼻黏膜損傷的保護作用，并初步探究SIL的可能作用機制，旨在為SIL用于臨床上NPC防治提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠共60只，6～7周齡，體質量（200±20）g，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0011。實驗前大鼠適應性飼養7 d，飼養條件溫度22～25 ℃，濕度45%～55%，晝夜時長12 h/12 h，期間不限制飲水飲食。研究經海口市第三人民醫院倫理委員會審核批準（審批號：2022013）。

1.1.2 實驗藥物與試劑 二亞硝基哌嗪（dinitrosopiperazine，DNP，SCSI-316048）購自上海賽可瑞生物科技有限公司；佛波醇酯（SL9964626）購自上海一基實業有限公司；SIL（B3746）購自北京康納瑞生物科技有限公司；IL-6/STAT3通路抑制劑（AG-490，HY-107459）購自美國MCE公司；HE染色試劑盒（G1120）、DAB顯色試劑盒（DA1016）、ECL發光試劑盒（PE0010）均購自北京索萊寶生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（YT2205）購自北京伊塔生物科技有限公司；IL-6、IL-10、IL-1β ELISA試劑盒（H007-1-1、H009-1、H002）均購自南京建成生物工程研究所；UBAP1抗體（ab89124）、IL-6抗體（ab259341）、STAT3（ab68153）、β-actin（ab8227）、山羊抗兔（HRP，ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.1.3 實驗儀器 OLYMPUS IX53顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；GelView 5000Plus智能凝膠成像系統購自廣州博鷺騰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組給藥 參照文獻［10］建立NPC大鼠模型：取50只SD大鼠，腋部皮下注射誘癌劑DNP 15 mg/kg，同時注射促癌劑佛波醇酯100 mg/kg，每3 d注射1次，7 d測量1次體質量，根據體質量變化調整用藥量，連續注射90 d。大鼠出現涕流滿面、抓鼻不止、頻繁打噴嚏等行為后進行組織病理檢測，以鼻咽組織出現癌變細胞表明NPC大鼠模型建立成功。建模成功后將大鼠隨機分為模型組、SIL-L組（50 mg/kg）、SIL-M組（100 mg/kg）、SIL-H組（200 mg/kg）、SIL+AG-490組（SIL200 mg/kg加AG-490 2 mg/kg混合液）。另選10只大鼠腋部皮下注射生理鹽水，作為空白對照組［11-12］。造模成功后各組給予相應藥物治療。模型組與空白對照組給予等體積生理鹽水。給藥方式均為腹腔注射，1次/d，連續給藥90 d。

1.2.2 ELISA法檢測鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平 末次給藥后12 h，用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，行氣管切開術。微量蠕動泵灌洗鼻腔，并收集鼻腔灌洗液，2 500 r/min離心15 min，取上清，ELISA檢測IL-6、IL-10、IL-1β。操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.3 HE染色觀察鼻黏膜組織病理變化 每組取5只大鼠取鼻黏膜組織，4%多聚甲醛中固定，常規石蠟切片，HE染色后生物光學顯微鏡下觀察鼻黏膜組織病理學變化。

1.2.4 TUNEL法檢測鼻黏膜組織細胞凋亡 取1.2.3中制備好的組織切片，常規脫蠟處理、二甲苯透明、梯度乙醇脫水后加蛋白酶K室溫孵育15 min，PBS漂洗，采用過氧化氫封閉10 min，再次漂洗，加入TUNEL工作液，進行染色，生物光學顯微鏡下觀察鼻咽組織細胞凋亡情況并拍照。采用Image J 7.0軟件進行圖像分析。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數（棕色）/細胞總數×100%。

1.2.5 免疫組化檢測鼻黏膜組織中UBAP1的表達 取1.2.3制備好的組織切片，脫蠟至水，枸櫞酸修復抗原，5%BSA封閉2 h，加入UBAP1一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗，37 ℃孵育2 h，DAB顯色，光鏡下觀察切片并拍照，采用Image J 7.0軟件分析積分光密度值，作為目的蛋白陽性表達量。

1.2.6 Western blot檢測鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達 取大鼠鼻黏膜組織，使用RIPA裂解液分離總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣，進行電泳、轉膜，5%BSA封閉2 h，加入IL-6、STAT3及內參β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，電化學發光試劑（efficient chemiluminescence，ECL）顯色，凝膠成像系統分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量，目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件分析實驗數據，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SIL對NPC大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平明顯升高，IL-10水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SIL-L、SIL-M、SIL-H組鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平依次降低，IL-10水平依次升高（P＜0.05），顯示出藥物具有劑量效應關系；與SIL-H組比較，SIL+AG-490組鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平顯著降低，IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的比較（±s，n=10，pg/ml）Tab.1 Comparison of IL-6， IL-10 and IL-1β levels in nasal lavage fluid of rats in each group （±s，n=10，pg/ml）

表1 各組大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的比較（±s，n=10，pg/ml）Tab.1 Comparison of IL-6， IL-10 and IL-1β levels in nasal lavage fluid of rats in each group （±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

IL-1β 24.25±2.28 87.18±8.371）73.84±7.182）65.86±5.952）3）53.21±5.342）3）4）34.82±3.285）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490 IL-6 35.47±3.56 121.49±10.261）94.16±8.662）78.58±6.852）3）61.28±5.582）3）4）49.54±4.225）IL-10 47.51±3.13 13.08±1.471）16.82±1.842）22.31±2.422）3）27.18±1.972）3）4）34.76±3.685）

2.2 SIL對NPC大鼠鼻黏膜組織病理變化的影響HE染色結果顯示：空白對照組大鼠鼻黏膜組織結構清晰，細胞排列整齊、形狀規則，未發現細胞癌變現象；模型組大鼠黏膜組織結構紊亂，大量細胞癌變，細胞層次增多，排列不規則；SIL各劑量組隨著劑量的增加，細胞形態逐漸清晰，癌變細胞逐漸減少；SIL+AG-490組大鼠鼻黏膜組織結構、細胞形態與空白對照組接近，細胞層次較清晰，癌變細胞數量較少。見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理變化情況（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of nasal mucosa of rats in each group （HE，×200）

2.3 SIL對NPC大鼠鼻黏膜組織細胞凋亡情況的影響 空白對照組大鼠鼻黏膜組織中的細胞凋亡率為（3.79±0.43）%；與空白對照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織細胞凋亡率（52.91±4.36）%顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SIL各劑量組隨著劑量升高，鼻黏膜組織細胞凋亡率逐漸降低（P＜0.05），細胞凋亡率分別為（41.76±3.24）%、（32.01±2.33）%、（24.38±2.07）%；與SIL-H組比較，SIL+AG-490組大鼠鼻黏膜組織細胞凋亡率（16.43±1.71）%顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織細胞凋亡情況（TUNEL，×200）Fig.2 Apoptosis of nasal mucosal tissue cells of rats in each group （TUNEL，×200）

2.4 SIL對NPC大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SIL各劑量組大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達顯著升高（P＜0.05），且具有劑量效應（P＜0.05）；與SIL-H組比較，SIL+AG-460組大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達顯著升高（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 各組大鼠鼻黏膜組織UBAP1表達的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of UBAP1 expressions in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

表2 各組大鼠鼻黏膜組織UBAP1表達的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of UBAP1 expressions in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

Nite：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

UBAP1 7.41±0.66 1.96±0.211）3.01±0.292）3.98±0.42 2）3）4.96±0.492）3）4）5.83±0.545）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490

2.5 SIL對NPC大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SIL各劑量組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達均明顯降低（P＜0.05），且各劑量組間具有劑量效應（P＜0.05）；與SIL-H組比較，SIL+AG-460組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。結果見圖4、表3。

圖4 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達的比較Fig.4 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group

表3 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

表3 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

STAT3 0.22±0.02 0.85±0.091）0.72±0.082）0.59±0.052）3）0.47±0.042）3）4）0.36±0.035）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490 IL-6 0.16±0.02 0.67±0.041）0.56±0.042）0.48±0.032）3）0.37±0.022）3）4）0.24±0.025）

3 討論

據WHO統計，全球有約80%的NPC患者在中國，并且，近年來由于人們生活方式以及生活環境的改變，其發病率及年輕化程度均逐年升高［13-14］。NPC起病隱匿、病情發展迅速，大多數患者確診時已發展至中晚期，且NPC發病與環境因素、遺傳因素以及病毒感染等有密切關系［15-16］。早期放化療能夠有效延長患者生命，但長期放化療易產生相關不良反應及放化療抵抗，因此，尋找安全有效的治療藥物對于臨床上NPC的防治工作具有重要意義。

IL-6、IL-1β是機體的關鍵促炎因子，研究表明其參與炎癥反應發生、機體免疫應激以及腫瘤細胞的增殖與侵襲［17］。UBAP1在NPC的發生與發展過程中均呈異常表達，其在NPC癌細胞惡性行為學的發展過程中發揮關鍵作用［18］。本研究結果顯示，NPC大鼠模型鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平升高，抑炎因子IL-10水平降低，鼻黏膜組織受損嚴重，鼻腔黏膜細胞癌變與凋亡增加，提示大鼠鼻腔黏膜炎癥反應激活，可誘導鼻黏膜細胞癌變與凋亡，同時鼻黏膜組織中UBAP1表達降低，促進NPC發展。

劉易婷等［19］曾通過建立DNP與硫酸鎳聯合誘導NPC大鼠模型，發現益氣解毒顆粒能夠有效降低NPC大鼠癌變發生率。SIL是菊科植物水飛薊的主要生物活性成分，其具有清除ROS、抗炎、抗氧化能力［20］。研究報道SIL抗腫瘤作用主要是通過抑制細胞凋亡、抵抗血管生成等作用抑制腫瘤生長［21］。本研究結果顯示，低、中、高劑量的SIL均能不同程度地下調IL-6、IL-1β表達，上調IL-10表達，減輕鼻黏膜組織炎癥反應及組織損傷，減少細胞癌變以及抑制鼻黏膜上皮細胞凋亡。

IL-6是參與調節免疫應答和炎癥反應的關鍵因子，其通過與下游受體sIL-6R結合，誘導下游效應因子STAT3活化，從而進一步促進炎癥因子的表達，加重機體損傷［22］。研究表明，IL-6/STAT3信號通路被激活后可引起過度炎癥反應， STAT3過表達影響腫瘤細胞的清除進而促進腫瘤的發生發展［23］。因此，抑制IL-6/STAT3信號通路，能夠有效減少NPC癌細胞增殖與侵襲［24］。本研究結果表明，NPC模型大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達明顯升高，提示NPC模型大鼠機體IL-6/STAT3信號通路被激活，炎癥反應加劇，從而促進鼻黏膜組織癌變，SIL-L、SIL-M、SIL-H組大鼠鼻咽部黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達均有不同程度的下調，提示SIL可抑制IL-6/STAT3信號通路的激活；且SIL配伍通路抑制劑AG-490干預后，IL-6、STAT3蛋白表達進一步下調，說明SIL可能通過抑制IL-6/STAT3信號通路的激活，進而發揮抗炎、抗凋亡作用，緩解NPC大鼠鼻黏膜組織炎癥損傷。

綜上所述，SIL通過抑制炎癥反應的發生和細胞凋亡減輕NPC大鼠鼻黏膜組織損傷，其作用機制可能與抑制IL-6/STAT3信號通路有關。