基于化學發光免疫技術檢測念珠菌IgG抗體方法的建立與性能評估

李靜靜 王雪琦 孫婭順 趙思琪 劉春龍 鐘成 （.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；.天津市侵襲性真菌病精準診斷技術企業重點實驗室，天津300467）

近年來，侵襲性真菌病的發病致死率不斷升高，調查數據顯示，其中80%的感染由侵襲性念珠菌病引起［1］。此外，血源性感染是醫院中最易發生的感染狀況，其中念珠菌是主要致病菌，血源性感染引起的致死率在使用抗真菌相關的治療手段后仍高居40%［2］。念珠菌是典型的條件致病菌，在人體腸道、口腔、陰道黏膜等常與其他微生物共存，當機體免疫力降低或外界環境對其進行給藥活動時可能發展為致病菌，在情況嚴重時，念珠菌病會侵染到機體各組織及器官，最終導致生命受到威脅，在已發現的念珠菌種類中有超過15種會引發機體感染，而大多數念珠菌感染均由白色念珠菌、光滑念珠菌及熱帶念珠菌引起［3］。侵襲性念珠菌病的易感因素包括念珠菌定植、接受廣譜抗菌藥治療、使用中央靜脈導管、住院時間延長、入住ICU、燒傷、早產、中性粒細胞減少、全身應用糖皮質激素、HIV感染及糖尿病等［4］。目前，關于念珠菌抗原與抗體檢測的相關研究逐漸增多，歐洲臨床微生物與感染性疾病學會于2012年提出：β-D葡聚糖（Beta-D-glycan，BDG）與甘露聚糖均可作為念珠菌病臨床相關的輔助診斷標志物［5］。BDG主要存在于大部分致病真菌細胞壁中，在檢測念珠菌時的特異度和靈敏度均為75%左右，但在念珠菌病的早期診斷中假陽性檢出率仍較高［6-7］；甘露聚糖則存在于常見念珠菌屬的細胞壁外側，當人體受念珠菌侵染后，甘露聚糖具備的強抗原性激發人體免疫系統識別甘露聚糖產生抗甘露聚糖抗體，抗甘露聚糖抗體應用于念珠菌病的檢測時其特異度可達到90%以上［8-9］。因此，建立一種高效的方法檢測念珠菌甘露聚糖抗體對診斷念珠菌病在臨床上具有重要意義。

目前，侵襲性念珠菌病的檢測方法主要有真菌培養、組織病理學檢查、酶聯免疫吸附實驗、PCR技術、G試驗以及影像學檢查，但微生物培養技術仍舊存在培養周期較長、靈敏度低等缺陷；PCR技術雖然能特異性檢測出樣本中的真菌核酸成分并有效區分所感染菌屬種類，但該技術由于儀器昂貴、檢驗過程缺乏標準化及敏感性過高易產生假陽性等缺點而在臨床早期診斷方面受限；ELISA檢測方法對實驗操作人員的技術要求較高，并且檢測耗費時間過長（通常＞2 h）；G試驗檢測僅能判定是否為真菌感染，對念珠菌特定甘露聚糖抗體的敏感特異度較低；影像學檢查費用昂貴，并不能作為對念珠菌病的早期快速診斷技術而普及［10-12］。近年來，化學發光技術不斷發展，在體外診斷領域中由于其檢測靈敏度高、線性范圍寬、光信號持續時間長、檢測結果穩定、實驗誤差小以及安全性能高等優勢而被廣泛應用［13-14］。相較傳統檢測手段而言，化學發光免疫分析技術能夠在短時間內完成對樣本中特定物質的檢測，實驗操作相對較簡單，不需要對樣本進行預處理，有效避免了檢測過程中人為引起的誤差［15］。

基于以上背景，本研究建立了一種快速檢測血清樣本中念珠菌甘露聚糖IgG抗體的條式化學發光技術。相對于裸磁珠體系，鏈霉親和素-磁微粒能夠與生物素-念珠菌甘露聚糖相結合并放大發光信號值；此外，該檢測體系聯合使用間接法與“兩步兩清洗”檢測有效避免了免疫檢測時易發生的鉤狀效應（HOOK效應）。建立該檢測體系后對相關性能指標進行評價，為臨床上侵襲性念珠菌病的早期診斷提供一種更加快速高效的輔助檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用念珠菌甘露聚糖抗原、羊抗人IgG抗體、念珠菌IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）、樣本稀釋液、發光底物及試劑條等均由丹娜（天津）生物科技股份有限公司提供；鏈霉親和素-磁微粒、N-羥基丁二酰亞胺（N-Hydroxy succinimide， NHS）活化生物素和堿性磷酸酶購自賽默飛世爾科技公司；血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油及其他鹽類試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。本研究所用樣本收集于四川大學華西醫院。本研究經四川大學華西醫院臨床試驗倫理審查委員會批準，［2021年臨床試驗（器械）審（41）號］，采集時間為2022年，對采集樣本進行編號后置于-20 ℃保存備用。

全自動化學發光免疫分析儀（成都宜樂芯生物科技有限公司，lumilite8）；全自動酶標儀（TECAN迪肯酶標儀，Infinite M200）。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法的建立 生物素標記念珠菌甘露聚糖抗原：使用0.02 mol/L pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）將念珠菌甘露聚糖抗原稀釋至1 mg/ml，以摩爾比1∶40加入相應的NHS活化生物素，振蕩混勻后避光置于室溫反應2 h。反應結束后用0.02 mol/L pH=7.4 PBS透析純化反應產物，4 ℃保存備用。

堿性磷酸酶標記羊抗人IgG抗體：將堿性磷酸酶以10 mg/ml濃度溶于0.1 mol/L pH=6.8的PBS中，加入戊二醛使得終濃度為1.25%，室溫過夜反應后透析以除去過量戊二醛；將羊抗人IgG抗體以10 mg/ml濃度溶于0.5 mol/L pH=9.5的碳酸鹽緩沖液（CBS）中，將活化的酶溶液以（每4 mg酶加入1 mg抗體比例）加入上述抗體溶液，4 ℃過夜反應；采用0.2 mol/L賴氨酸- CBS溶液（0.5 mol/L pH=9.5）加入反應體系，4 ℃反應1 h終止反應，反應產物用0.02 mol/L pH=7.4 PBS透析純化后加入50%甘油，-20 ℃保存備用。

使用標記完成的生物素-念珠菌甘露聚糖抗原（bCA）與鏈霉親和素-磁微粒混合反應，加入堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體（AP-IgG）后檢測不同陰陽性樣本以驗證生物素與念珠菌甘露聚糖是否成功標記，進而確定本研究方法最適的bCA與AP-IgG反應濃度［選取bCA不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml）與AP-IgG不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml）進行正交試驗］，最終建立一種檢測血清樣本中念珠菌甘露聚糖IgG抗體的方法。

1.2.2 分析靈敏度 依據參考指南Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures；Approved Guideline-Second Edition（EP17-A02）對檢測體系的分析靈敏度進行評估驗證。

空白限（limit of blank， LoB）評估方法：選取5例空白樣本，同時使用2臺全自動化學發光免疫分析儀持續測試3 d，其中每個空白樣本每天均進行3次平行試驗，測試完成后評估檢測方法的LoB。檢出限（limit of detection，LoD）評估方法：確定LoB，選取5例低濃度樣本（1～1.5 LoB），同時使用2臺全自動化學發光免疫分析儀，持續測試3 d，每天每個樣本均需進行3次重復試驗，測試完成后評估檢測方法的LoD。

1.2.3 精密度與重復性 使用雙因子嵌套方差分析方法對本研究方法重復性及精密度進行評價。選取5個不同濃度樣本以及2個質控品持續測試10 d，使用2批次試劑每天對每個樣本進行6次生物學重復試驗，最終使用標準差SD值與變異系數%CV值表示精密度及重復性。

1.2.4 分析特異性 隨機選取高、中、低濃度曲霉IgG抗體（GM-IgG）、結核分枝桿菌IgG抗體（TBIgG）、肺炎支原體IgG抗體（MP-IgG）以及肺炎衣原體IgG抗體（CP-IgG）陽性樣本數例，使用本研究所建立方法進行檢測判定體系是否存在交叉反應。

選取高、低濃度陽性樣本與陰性樣本，分別加入不同劑量血紅蛋白、三酰甘油和膽紅素進行測試，將加入不同干擾因子后的測試濃度與加入前濃度進行對比，計算相對偏差（RD）對本研究建立體系的特異性進行評價。

1.2.5 方法學對比 使用念珠菌IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）與本研究建立方法分別對150例臨床樣本進行檢驗分析，參照CLSI EP12-A2指南推薦方法、回歸分析與偏差分析對兩種方法以及一致性程度的95%置信區間進行評價；并計算Kappa值以描述兩種方法一致性強度（一致性強度分區為極強：0.81＜Kappa值＜1.00，較強：0.41＜Kappa值＜0.80，弱：0.21＜Kappa值＜0.40，較弱：0＜Kappa值＜0.20，極弱：0＜Kappa值［16-17］）。

1.3 統計學處理 本研究數據處理均使用Med-Calc、Minitab 18和Excel 2019軟件進行分析。檢測方法所使用標準曲線由最小二乘法進行線性擬合得到。樣本濃度均使用全自動化學發光免疫分析儀中四參數Logisitic擬合曲線進行計算。

2 結果

2.1 檢測體系建立 使不同濃度的bCA與AP-IgG進行正交試驗，并記錄陰陽性樣本信號值比值（P/N值）如圖1所示，生物素與念珠菌甘露聚糖成功標記產生有效光信號值，在圖1中表明不同濃度bCA與AP-IgG反應時P/N值會隨之變化；經驗證確定bCA與AP-IgG濃度均為1 μg/ml時，樣本P/N值呈現較高峰值（P/N=25.06）。在最優條件下，使用濃度為10、25、50、100、250、500 ng/ml的標準品建立該檢測體系標準曲線如圖2所示，念珠菌甘露聚糖IgG抗體檢測體系線性回歸方程為y=1.74×107-1.74×107/［1+（x/199 71.03）］，線性相關系數R2為0.998 7，符合臨床應用技術標準。

圖1 不同濃度bCA與AP-IgG對樣本P/N值的影響Fig.1 Effect of different concentrations of bCA and APIgG on P/N values of samples

圖2 檢測體系標準曲線Fig.2 Standard curve for testing system

因此，本研究方法所使用生物素與多糖類標記方法可行，基于化學發光免疫技術檢測樣本中念珠菌甘露聚糖IgG抗體的方法初步建立。

2.2 靈敏度分析 根據EP17-A2指南所述方法計算并驗證檢測體系LoB與LoD，確定本研究建立體系LoB為5.20 AU/ml，LoD為5.50 AU/ml。

2.3 精密度與重復性 使用雙因子嵌套方差分析方法，評價本研究建立體系精密度與重復性，結果如表1所示，以SD值與CV值表示的重復性評價中，CV值均＜10%，證明在外界因素盡可能相同的情況下，使用本研究所建立體系檢測同一樣本時具有較高一致性。另一方面，室內精密度與批間精密度評估結果CV值同樣均＜10%，表明所建立體系在實驗室內進行時不同批次間存在的變異性較小。因此，關于精密度與重復性的分析結果表明本研究方法能夠滿足臨床相關輔助診斷技術的要求；同時，該分析方法也可以應用于相關檢測儀器的故障排除工作中，從而進一步提高相關輔助診斷技術的臨床準確性。

表1 精密度與重復性檢測結果Tab.1 Precision and repeatability test results

2.4 分析特異性

2.4.1 交叉反應 對臨床診斷過程中易發生交叉反應的特異性病原體樣本進行檢測，檢測結果證明（圖3）使用本研究建立體系所測含有不同特異性抗體陽性樣本濃度值基本與念珠菌IgG抗體陰性（CAIgG）樣本檢測結果一致。因此，常見特異性抗體對本研究方法不存在交叉影響。

圖3 本研究體系檢測可能存在交叉反應特異性抗體結果Fig.3 Testing system detects possible cross-reactive specific antibody results

2.4.2 干擾因素 臨床診斷時樣本會出現病理性溶血或技術性溶血，進而導致樣本檢測結果受到干擾，見表2。當血紅蛋白濃度＜0.5 mg/ml時會出現肉眼不可見的非顯性溶血現象；當濃度＞5 mg/ml時則會出現重度溶血現象。實驗結果表明，在不同濃度樣本中添加血紅蛋白含量高達7 mg/ml時對檢測結果仍無顯著干擾。正常人血清樣本中三酰甘油最高可達1.7 mmol/L，本研究結果證明，在不同濃度樣本中添加三酰甘油含量高達7.5 mmol/L時，檢測結果的相對偏差均＜10%。因此，樣本中添加三酰甘油對本研究所建立體系的檢測結果并無干擾。臨床檢驗時血清樣本中總膽紅素正常含量范圍為2.98～10.00 mg/L，重度黃疸患者總膽紅素含量范圍為200～300 mg/L。檢測結果表明，當各濃度樣本中膽紅素含量達到300 mg/L時，檢測結果RD仍低于10%。因此，樣本中膽紅素含量＜300 mg/L時對本研究體系檢測結果無影響。

表2 添加不同含量常見干擾物質后對本研究方法檢測結果的影響Tab.2 Effects of adding different contents of common interfering substances on detection results of this research method

2.5 方法學對比 參照指南分別使用ELISA法與本研究方法對臨床來源樣本進行檢測并對結果進行回歸分析與偏差分析。兩種方法的回歸分析表明二者相關程度較高（R2=0.989 8，圖4），初步證明兩種檢測體系一致性較好。此外，如圖5，在檢測結果偏差分析中設定95%置信區間為檢測上下限，結果表明96%的本研究方法與ELISA法在一致性范圍內，即兩方法的最大差異性在臨床檢測可允許發生范圍內。

圖4 兩種方法學回歸分析（n=150）Fig.4 Two methods of regression analysis （n=150）

圖5 檢測結果偏差分析Fig.5 Deviation analysis of detection results

使用2×2列聯表與Kappa值對兩種方法檢測的一致性強度進行評估，檢測結果如表3所示，兩種檢測方法的陽性符合率為87.5%，陰性符合率為90.8%，總體符合率為90%；根據Kappa值公式計算出兩方法的Kappa值為0.80，即二者具有較強的一致性強度。綜上所述，本研究建立檢測體系與現有檢測方法具有較好一致性，可以將本研究方法應用于念珠菌病的臨床輔助診斷。

表3 本研究方法與ELISA法檢測150例臨床樣本結果Tab.3 This method and ELISA were used to detect results of 150 clinical samples

3 討論

目前，關于念珠菌病的檢測試劑盒主流市場多為ELISA法與PCR檢測方法，其中ELISA法的應用雖具有較高認可度，但在檢測過程中也存在不可避免的劣勢：①檢測過程中對操作人員技術要求較高，易出現人為因素引起的誤差；②檢測時平行性與時效性較差。而PCR檢測手段則存在技術要求高且試驗儀器較昂貴等弊端。因此，較于現有檢測技術，本研究建立一種基于化學發光免疫技術的念珠菌甘露聚糖IgG抗體檢測方法，其具備靈敏度高、信號值持續時間長、分析方法便捷、檢測結果穩定且誤差小以及安全性高等優點。近年來，傳統化學發光平臺多使用裸磁珠體系與大型全自動發光設備，但因其設備較大、管路清洗復雜導致檢測重復性差等缺陷在使用上存在限制性。

綜合考慮上述問題，本研究選用小型化學發光平臺與獨立條式樣品架以解決設備占用面積大、管路清洗復雜而干擾實驗結果等問題；在此基礎上選用鏈霉親和素-磁微粒為載體，生物素標記抗原與其多位點結合進一步增強發光信號值。對本研究所建立檢測方法進行系列性能評估，經分析評價確定檢測方法LoB為5.20 AU/ml，LoD為5.50 AU/ml，較現有ELISA檢測技術（分析靈敏度為17.50 AU/ml）有所提高；精密度與重復性方面，CV值均＜10%表明檢測方法可行性的同時實驗誤差較小；對于所建立檢測方法的分析特異度方面，常見干擾物質與易發生交叉反應的特異性抗體對其均無顯著性影響。此外，對確診臨床樣本使用本研究所建立方法進行檢測發現，使用所建立檢測方法檢測時陰、陽性樣本符合率均＞85%；在方法學一致性分析方面，本研究體系與ELISA法具有較強的一致性強度，且本研究方法與ELISA法的檢測差值符合95%置信區間浮動的要求，回歸分析中二者相關系數R2=0.989 8＞0.975 0也證明兩種方法具有較高一致性，均滿足臨床檢測需求。

因此，根據相關性能評價與分析，以鏈霉親和素-磁微粒為載體，與生物素標記念珠菌甘露聚糖相結合，在堿性磷酸酶偶聯羊抗人IgG抗體作為發光標志物與發光底物進行檢測的方法成功建立。同時，該檢測方法相關性能指標均符合臨床診斷技術的要求，與現有產品一致性強度較高，為未來念珠菌病的臨床診斷提供了一種更加高效且便捷的檢測技術。