重樓皂苷I預防給藥對心肌缺血再灌注損傷大鼠調節PI3K/AKT信號通路的作用研究*

田俊斌 趙靜 羅斌 呂建瑞 馬磊

(西安交通大學第二附屬醫院麻醉科,陜西 西安 710004)

心血管疾病是嚴重威脅人們健康的一大疾病,其發病率和死亡率較高,已經成為全球醫學挑戰之一[1]。近年來隨著動脈旁路移植術和休克療法(經皮冠狀動脈介入治療以及溶栓療法等技術)的廣泛推廣和應用,心血管疾病患者生存率得到有效增加。然而,介入治療屬于有創性手術操作,具有一定術后風險,特別是術后發生的心肌缺血-再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion,MI/ IR)損傷,其損傷程度已經成為患者康復和預后的關鍵影響因素[2]。重樓皂苷I是從中藥重樓中提取的一種皂苷類化合物,相關研究[3-4]報道,重樓皂苷I具有抗炎,抗腫瘤,抗病毒,降低膽固醇,降血壓等藥理活性。近年來研究發現[5],重樓皂苷I對MI/ IR損傷具有一定的保護作用,但具體作用機制仍未完全明確。基于此,本研究擬構建MI/IR大鼠模型,以經典磷脂酰肌醇-3-激酶 (p-Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(p-Protein kinase B,AKT)信號通路為切入點,探究重樓皂苷I對MI/ IR損傷的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料和儀器

1.1.1 實驗動物 72只SPF級SD大鼠,雌雄各半,大鼠體重240～260 g,購于西安交通大學醫學院動物學部[許可證號: SCXK(陜)2020-001]。大鼠購買后全部飼養于西安交通大學醫學院動物實驗中心,實驗中心由中央空調統一控制溫度和濕度,溫度為22～25 ℃,濕度為60%～70%,采光由日光燈提供,明暗均為12 h。所有動物實驗操作均獲西安交通大學第二附屬醫院倫理委員會審批(審批號:2023265)。

1.1.2 藥物與試劑 重樓皂苷I(純度94%,上海純優生物科技公司,貨號:P0275);阿司匹林(山東新華制藥股份有限公司,國藥準字H37020354);大鼠肌酸激酶同工酶MB(Creatine Kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽 (Glutathione,GSH)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,貨號分別為:ml059533、ml092588、ml059334,ml093071、ml094962和ml094991);氯化三苯基四氮唑(TTC)(美國Sigma 公司,貨號:3923356);HE染色試劑、TUNEL檢測試劑盒(綠色熒光)和BCA 試劑盒(江蘇碧云天生物科技公司,貨號分別為:C0105M、C1098和P0009);PI3K、AKT、B細胞淋巴瘤/因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關蛋白(Bax)、GAPDH和二抗(HRP)(英國Abcam 公司,貨號分別為:ab139307、ab283852、ab182858、ab181602和ab201822)。

1.1.3 主要儀器 動物心電圖系統(美國Nasiff Associates 公司,型號: ECG);超高分辨率小動物彩色多普勒超聲儀(加拿大VisualSonics 公司,型號:Vevo 2100);多功能酶標儀(美國Bio-Rad 公司,型號:iMark680);顯微鏡(日本奧林巴斯公司,BX61型)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模 72只大鼠標號后隨機分為6組,分別為假手術組(等體積1% DMSO灌胃)、模型組(等體積1% DMSO灌胃)、阿司匹林組(20 mg·kg-1·d-1)、以及重樓皂苷I低劑量組(75 mg·kg-1·d-1重樓皂苷I灌胃治療)、中劑量組(150 mg·kg-1·d-1重樓皂苷I灌胃治療)和高劑量組(300 mg·kg-1·d-1重樓皂苷I灌胃治療),每組12只(依照文獻報道[6-8],每組10～20只均可,本研究每組12只符合樣本量)。適應性喂養2周后開始給藥,給藥時間也為2周,上述時間共4周。

1.2.2 MI/IR動物模型的構建 本研究根據文獻報道[7],采用冠脈左前降支結扎術構建MI/IR大鼠模型。具體為:將大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉,麻醉后將其呈仰臥狀固定于手術臺,并連接動物呼吸機以實時監測其心電圖,完成后沿大鼠左胸骨旁邊的第3和第4肋骨的中間開胸,打開胸腔、剪開心包膜以使心臟充分暴露,找到心臟左心耳的下緣處2 mm處進針(出針位置為肺部的動脈圓錐旁),進針深度為1 mm,進針后使用6-0縫線及充氣球囊一起使用后結扎左冠脈前降支,之后關閉胸腔,當球囊充滿氣、心電圖上顯示有明顯的ST段升高確定為缺血模型成功構建,此時給予缺血45 min,然后抽空球囊,給予再灌注6 h,當心電圖上顯示有明顯的ST 段下降(50%以上)即可判定為再灌注模型成功構建,假手術組只給予開胸后冠脈穿線但并不結扎。

1.2.3 大鼠心臟彩超評估 根據文獻在大鼠再灌注24 h后[8](實驗中觀察到所有大鼠已完全清醒,能夠簡單活動)采用小動物彩色多普勒超聲儀檢測每組大鼠左心室射血分數(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室舒張末期壓(Left Ventricular End Diastolic Pressure,LVEDP)、左室內壓最大上升速率(Maximal left ventricular pressure rising rate,+dp/dtmax)、左室內壓最大降低速率(Maximum reduction rate of left ventricular pressure,-dp/dtmax)。

1.2.4 大鼠心肌梗死面積檢測 大鼠心肌梗死面積的測定采用TTC法[9],具體為處死大鼠后立即取出心臟(分成四個部分,一部分用于心肌梗死面積測定,一部分用于病理學檢測,一部分用于蛋白表達的檢測,剩余部分保存備用),將其置入-80 ℃ 的超低溫冰箱中5 min,然后取出切成6塊厚度為1～2 mm的心肌組織,再將其放入1%的TTC 溶液中避光孵育30 min,最后取出采用4%的多聚甲醛溶液固定24 h,收集圖像通過Image-Pro Plus 6.0軟件測量并計算心肌梗死面積即可(梗死區為灰白色區域,缺血未梗死區為紅色區域),心肌梗死面積百分比(%)= (心肌梗死面積/心肌總面積)×100%。

1.2.5 HE染色檢測心肌組織病理學 取一小塊心肌組織,用4%多聚甲醛溶液固定48～72 h后取出,超純水反復沖洗后,采用石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、固定即完成,然后采用光學顯微鏡照片并收集圖像即完成,每張圖片選取6個不同的視野。

1.2.6 相關生化指標(心肌損傷標志物和氧化應激因子)檢測 采用低溫高速離心機將腹主動脈取血法收集的血液離心(離心速度3 000×g,離心時間5 min,離心半徑6 cm),血清收集后采用試劑盒提供的說明書進行檢測即可,其中心肌損傷標志物指標為CK-MB、LDH和AST,氧化應激因子指標為MDA、GSH和SOD。

1.2.7 TUNEL檢測心肌細胞凋亡 采用TUNEL染法檢測心肌組織中細胞的凋亡情況,將HE染色固定的心肌組織取出后,切片,脫蠟,依次用PBS洗滌3次、蛋白酶K浸泡30 min、H2O2(3%)浸泡10 min,上述完成后37 ℃條件下采用TUNEL 混合液避光孵育1 h,采用DAPI染色細胞核10 min,完成后采用PBS洗滌二次后即可封片。采用熒光倒置顯微鏡收集圖像,每張圖片選取4個不同的視野。分析比較時綠色熒光為TUNEL染色的凋亡細胞,藍色熒光為DAPI染色的細胞核,綠色越多表明凋亡越嚴重。

1.2.8 Western blot檢測相關蛋白的表達 PI3K、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達量的測定采用Western blot法,采用組織蛋白裂解液提取心肌組織中的總蛋白,蛋白提取后對其進行定量并調平,然后每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳,待電泳結束后裁剪目的蛋白的膠帶將其蛋白轉移到PVDF 膜,脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗封閉過夜,次日取出后加入二抗孵育1 h,采用凝膠成像儀收集圖像即完成,結果比較以GAPDH為內參,目的蛋白/GAPDH的灰度值所測蛋白的箱規表達量。

2 結果

2.1 重樓皂苷I對心肌組織病理學的影響 心肌組織HE染色結果顯示,假手術組心肌細胞形態完整且規則,同時可見心肌纖維排列整齊,無水腫以及炎癥反應,而模型組大鼠則出現紊亂的心肌纖維排列以及部分心肌纖維的斷裂。與模型組相比,重樓皂苷I低、中、高劑量組和阿司匹林組均明顯好轉,但重樓皂苷I低、中、高劑量組和阿司匹林組相比仍有一定的差異。見圖1。

圖1 大鼠心肌組織HE染色結果圖(400×)

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較 與假手術組相比,模型組大鼠心肌梗死面積的相對范圍明顯增加(t=24.052 0,P<0.001);而相較于模型組,阿司匹林和重樓皂苷I低、中、高劑量組均可明顯降低大鼠心肌梗死面積(t=13.211 7、5.040 7、7.845 8、9.989 7,均P<0.001),但重樓皂苷I低、中、高劑量組并未優于阿司匹林組,甚至表現為高于阿司匹林組(P<0.001)。見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較

2.3 重樓皂苷I對大鼠血流動力學的影響 相較于假手術組,模型組大鼠LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯降低(P<0.05),而LVEDP則明顯升高(P<0.05);相較于模型組,重樓皂苷I低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯升高(P<0.05),而LVEDP則明顯降低(P<0.05),但重樓皂苷I低、中、高劑量組相較于阿司匹林組仍然有一定的差異(P<0.05)。見表2。

表2 重樓皂苷I對大鼠心臟血流動力學的影響

2.4 重樓皂苷I對大鼠血清和心肌心功能指標的影響 相較于假手術組,模型組大鼠血清以及心肌組織中心功能指標LDH、CK-MB和AST均明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05);相較于模型組,重樓皂苷I低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠血清和心肌組織中心功能相關指標LDH、CK-MB和AST均明顯降低(P<0.05),但重樓皂苷I低、中、高劑量組相較于阿司匹林組仍然有一定的差異(P<0.05)。見表3、表4。

表3 重樓皂苷I對大鼠血清心功能指標LDH、CK-MB和AST的影響

表4 重樓皂苷I對大鼠心肌組織心功能指標LDH、CK-MB和AST的影響

2.5 重樓皂苷I對大鼠血清和心肌中氧化應激指標的影響 相較于假手術組,模型組大鼠血清和心肌組織中MDA水平均明顯升高(P<0.05),而SOD和GSH則明顯降低(P<0.05);相較于模型組,重樓皂苷I低、中、高劑量組血清和心肌組織中MDA 明顯降低(P<0.05),SOD和GSH則明顯升高(P<0.05);此外,與阿司匹林組相比,重樓皂苷I高劑量組MDA明顯降低(P<0.05),而SOD和GSH則明顯升高(P<0.05)。見表5、表6。

表5 重樓皂苷I對大鼠血清MDA、SOD和GSH的影響

表6 重樓皂苷I對大鼠心肌組織MDA、GSH和SOD的影響

2.6 TUNEL染色觀察心肌組織凋亡變化特點 各組心肌組織凋亡變化特點顯示(藍色部分為細胞核,綠色部分為心肌細胞凋亡后的圖像)。假手術組幾乎沒有發生心肌細胞凋亡(僅有一個綠色凋亡點),而模型組呈現出明顯的大量的細胞凋亡,與模型組相比,阿司匹林組和重樓皂苷I低、中、高劑量組凋亡情況明顯好轉,但重樓皂苷I低、中、高劑量組相較于阿司匹林組仍有一定的差異,表現為綠色熒光依然較多。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況(Tunel法,400×)

2.7 對PI3K、AKT蛋白表達的影響 相較于假手術組,模型組大鼠心肌組織中PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表達均明顯降低(P<0.05),而Bax表達則明顯升高(P<0.05);相較于模型組,重樓皂苷I低、中、高劑量組以及阿司匹林組PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表達均明顯升高(P<0.05),而Bax蛋白表達則明顯降低(P<0.05);此外重樓皂苷I低、中、高劑量組PI3K表達明顯高于阿司匹林組(P<0.05),重樓皂苷I高劑量組AKT明顯高于阿司匹林組(P<0.05),重樓皂苷I中劑量組和高劑量組Bcl-2表達明顯高于阿司匹林組(P<0.05),重樓皂苷I中劑量組和高劑量組Bax表達明顯低于阿司匹林組(P<0.05),見圖3、表7。

表7 各組大鼠心肌組織中PI3K、Akt、Bcl-2和Bax蛋白相對表達量

圖3 各組大鼠心肌組織中PI3K、AKT、Bcl-2和Bax蛋白表達圖

3 討論

中藥重樓是廣泛應用的一種中藥材,在中醫學中具有重要地位,其根莖和地上部分均有藥用價值。相關古籍記載重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效[9]。現代藥理學研究表明,重樓皂苷是重樓主要活性成分,其中重樓皂苷I的藥用價值極高[10],主要表現在抗細胞凋亡以及抗腫瘤方面[11]。近年來研究發現,重樓皂苷I在防止心血管疾病方面具有極大的優勢[12]。江振濤等[13]研究發現重樓皂苷I能明顯改善病毒性心肌炎,明顯降低心肌炎癥指標IL-6、TNF-ɑ和IL-1β的含量,并分析其作用機理可能與其能夠調控心肌Bax和Bcl-2的表達有關。王娓娓等[14]實驗研究結果表明,重樓皂苷Ⅰ可能通過降低鈣粘蛋白表達,導致體外培養的人冠狀動脈內皮細胞(HCAEC)生長發育及結構異常,進而抑制HCAEC增值并誘導其凋亡。還有學者[5]構建MI/IR損傷動物模型,予以重樓皂苷I干預后發現重樓皂苷能明顯緩解MI/IR損傷,但是具體的作用機制仍然是不明確的。因此本研究也采用重樓皂苷I干預MI/IR損傷動物模型,研究中設置阿司匹林為陽性對照藥,原因是阿司匹林作為臨床心血管疾病治療的二級預防用藥,在預防和治療MI/IR損傷方面已經被公認[15]。本研究從心功能、病理學、Tunnel染色結果可以明顯看出,與假手術組相比,模型組表現有明顯的心肌損傷,以及心肌凋亡和心功能相關指標異常,予以重樓皂苷I干預后,上述指標均有明顯的好轉,該結果提示重樓皂苷I對MI/IR損傷具有明顯的改善作用。然而,阿司匹林對MI/IR損傷的改善作用不及重樓皂苷I,原因可能是這兩種藥物治療MI/IR損傷的作用靶點不一致。

近年來研究表明,PI3K/AKT 信號通路與本病的發生發展密切相關,通過調控PI3K/AKT 信號通路能夠有效的減緩MI/IR損傷造成的心肌細胞損傷[8,16]。葉楨干等[17]探究了血根堿處理后對MI/IR損傷的作用,研究結果發現血根堿能夠通過調控PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達,進而降低炎癥反應,最終改善心肌損傷。閆清支等[18]用蒙藥額爾敦-烏日勒干預MI/IR損傷大鼠,結果提示,蒙藥額爾敦-烏日勒能夠有效的調節PI3K-AKT-m TOR通路防止細胞過度自噬,進而保護心肌細胞。PI3K/AKT是細胞中一個經典的信號通路,能夠通過調控下游Bcl-2家族蛋白基因的表達,進而調控細胞的凋亡以及抗氧化能力的平衡[19]。Bcl-2是人體內調節細胞凋亡的關鍵基因,主要有兩類,一類為抗凋亡蛋白,主要有Bcl-2,Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1,另一類為促凋亡的蛋白,主要有Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik、Bid等,在上述兩大類基因中,PI3K/AKT直接調控的凋亡因子為Bcl-2和Bax,通過調節Bcl-2和Bax兩個蛋白的表達不僅能夠直接調控細胞的凋亡[20-21],也可調節下游氧化應激指標SOD、MDA和GSH的含量[22]。因此,本研究觀察了重樓皂苷I對上述PI3K/AKT信號通路及其調控的凋亡蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表達特點。研究結果發現,相較于假手術組,模型組大鼠心肌組織中PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表達均明顯降低,Bax表達顯著升高;相較于模型組,重樓皂苷I低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠心肌組織中PI3K、AKT和Bcl-2蛋白均明顯升高,Bax蛋白表達顯著降低;值得注意的是,重樓皂苷I對上述蛋白表達的調控更明顯,且優于阿司匹林。此外,氧化應激指標SOD、GSH和MDA也呈現有相同的趨勢。相較于假手術組,模型組大鼠血清和心肌組織中MDA水平均明顯升高,SOD和GSH水平明顯降低;相較于模型組,重樓皂苷I和阿司匹林組大鼠血清和心肌組織中MDA水平明顯降低,SOD和GSH顯著升高。重樓皂苷I對上述指標的改善同樣優于阿司匹林組,其中重樓皂苷I高劑量效果更顯著。綜上,本研究結果證實重樓皂苷I可能通過調控PI3K/AKT信號通路,調節相關凋亡蛋白的轉錄,進而逆轉MI/IR損傷,減輕心肌細胞凋亡。

4 結論

重樓皂苷I對MI/IR損傷大鼠心功能、心肌組織病理學均具有明顯的改善作用,其作用機理可能與重樓皂苷I能夠調節PI3K/AKT信號通路,進而減輕心肌細胞凋亡,逆轉MI/IR損傷有關。該實驗進一步挖掘了重樓皂苷I的現代科學內涵,并為MI/IR損傷的臨床治療提供了新的治療思路及方法。