乳腺癌中BACH 1、HO-1的表達及丹皮酚的調控研究①

楊芳芳,李睿慧,王建杰

(佳木斯大學基礎醫學院,黑龍江 佳木斯 154007)

目前,全球乳腺癌的發病率呈增長趨勢,特別是在發展中國家。在中國,乳腺癌也是女性中最常見的惡性腫瘤之一[1,2]。因此,進一步研究乳腺癌的分子機制并為其提供有效的治療方案變得尤為重要。目前發現,BACH 1是一種轉錄抑制因子,它通過抑制HO-1的表達在氧化應激調節中起著重要作用。BACH 1在核內與HO-1啟動子AREs緊密結合,從而抑制HO-1的表達。越來越多的研究表明BACH 1和HO-1在腸癌、肺癌、乳腺癌等癌癥中的異常表達有助于腫瘤的轉移[3,4]。丹皮酚是中藥牡丹皮中的活性成分,具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種活性。研究顯示,丹皮酚對多種腫瘤的細胞增殖均具有抑制作用。先前研究表明,丹皮酚對EMT6乳腺癌小鼠和人MCF-7乳腺癌細胞具有抑制作用,可誘導細胞凋亡以及調節乳腺癌相關信號通路,其涉及了活化Caspase3和改善小鼠免疫功能等[5-7]。而丹皮酚的抗腫瘤作用是否通過調控BACH 1、HO-1的表達抑制乳腺癌細胞生長還未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年9月至2018年7月在佳木斯大學附屬第一醫院和佳木斯市中心醫院進行手術的114例女性乳腺癌患者所切除的癌組織和癌旁組織標本,并取得了患者知情同意和倫理委員會的批準。獲得其臨床病理學特征,包括年齡、淋巴結狀態、腫瘤分級和腫瘤轉移分期(TNM)。患者均為女性,年齡30～80歲,平均50.8歲。標本由114個乳腺癌組織和30個匹配的癌旁(對照)組織組成。腫瘤轉移(TNM)分期標準參考世界衛生組織2005年確定的腫瘤分級標準。

1.2 實驗試劑

MDA-MB-468細胞株(中國醫學科學院腫瘤研究所);丹皮酚(沈陽藥科大學);CCK-8試劑盒(碧云天生物公司);抗BACH 1、抗HO-1單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒(Santa Cruz公司);β-actin抗體(Abcam公司);SDS-PAGE(弗德公司);光學顯微鏡及照相系統(Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法

將組織樣本進行固定后石蠟包埋,然后切片處理。一抗BACH 1(1:50)、HO-1(1:100)孵育過夜。二抗孵育20min后,滴加SABC使二抗結合物增強。DAB顯色,在光鏡下觀察并捕獲圖像。

1.3.2 細胞培養

將MDA-MB-468細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中,37℃,5%CO2的培養箱培養,隔天觀察,適時傳代。

1.3.3CCK-8檢測丹皮酚對乳腺癌細胞增殖的影響

不同濃度丹皮酚處理MDA-MB-468細胞,接種于24孔板中培養,每組5個平行孔,48h, PBS清洗重復三次,將無血清的培養基和CCK-8按10∶1配制試劑,每孔加入100μL試劑,培養箱孵育2h后將上清液轉移到96孔板中,每孔設置5個復孔,酶標儀450nm時測定吸光度OD值。

1.3.4Transwell法檢測MDA-MB-468細胞的細胞遷移能力

無血清培養基輕柔重懸細胞(6×104個/mL),取200μL(0.2mL)稀釋的細胞懸液于小室中。取600μL 20%完全培養基加至小室下方24孔培養板中,置于恒溫培養箱中培養,用95%酒精固定,0.1%的結晶紫染色15min。顯微鏡下觀察穿膜數并拍照。

1.3.5Westernblot檢測MDA-MB-468細胞BACH1、HO-1的表達

提取細胞內總蛋白,按照BCA試劑盒步驟操作。轉膜,封閉后加入抗體β-actin(1:1000)、BACH 1(1:1000)、HO-1(1:2000),4℃過夜。將膜放于二抗中搖床上孵育1h。TBST清洗后,成像系統觀察蛋白條帶,并導出圖片。應用LabWork 3.0 UVP軟件計算蛋白質條帶強度。

1.4 統計學方法

采用SPSS25.0進行統計分析,兩組間比較t檢驗,多組間比較F檢驗。臨床參數使用χ2分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織中BACH 1、HO-1表達

BACH 1、HO-1在乳腺癌和癌旁組織中的表達情況,見圖1。與對照組(圖1A)相比,BACH 1(圖1B)表達降低。HO-1與對照組相比表達升高(圖1C、D)。

A.乳腺癌旁組織中BACH 1; B. 乳腺癌組織中的BACH 1;C. 乳腺癌旁組織中 HO-1;D. 乳腺癌組織中的 HO-1。數據來自每張玻片隨機3～5個視野。

2.2 BACH 1、HO-1表達與臨床病理參數之間的關系

在114例乳腺癌組織中,44例BACH 1高表達,70例低表達,HO-1 76例高表達,38例低表達。通過分析BACH 1、HO-1的表達情況與臨床資料之間的相關性,結果發現BACH 1與腫瘤TNM分期顯著相關,HO-1表達水平與腫瘤分級顯著相關(P<0.05),見表1。

表1 BACH 1、HO-1的表達與乳腺癌臨床病理參數的關系(%)

2.3 CCK-8法檢測細胞增殖

不同濃度的丹皮酚處理MDA-MB-468細胞48 h,發現60mg/L的Pae對于乳腺癌細胞產生了顯著的抑制作用(P<0.05,vs對照組),后續實驗操作將用60mg/L濃度。

2.4 Transwell法檢測丹皮酚處理MDA-MB-468細胞的細胞遷移能力

與對照組細胞相比,丹皮酚處理后細胞小室基底膜的細胞數目下降。因此認為丹皮酚,對乳腺癌細胞遷移能力有抑制作用,見圖2。

A.對照組; B.丹皮酚組

2.5 丹皮酚對細胞BACH 1、HO-1蛋白表達的影響

應用Western Blot分析BACH 1、HO-1蛋白表達。與對照組相比,BACH 1表達上調,HO-1表達減弱,見圖3。

A. Western印跡法以β-actin作為對照BACH1和HO-1的表達; B. 蛋白相對表達水平(n=3,表示±SD)*P <0.05對照。

3 討論

本研究通過對乳腺癌患者癌組織與癌旁組織BACH 1與HO-1表達檢測并分析其與臨床特征的相關性,發現乳腺癌組織中BACH 1低表達,而非癌組織中只有20%BACH1低表達,并發現低BACH 1表達與腫瘤分期顯著負相關。而HO-1高表達與腫瘤分級有關,低分化腫瘤HO-1表達高于高/中分化腫瘤。BACH 1為一種轉錄因子,在細胞周期中對很多基因進行負調控,在細胞凋亡和氧化應激反應中起著重要作用。可以被看作為腫瘤抑制因子。研究報道,BACH 1負調節HO-1的表達以抑制細胞凋亡并增加癌細胞增殖。BACH 1低表達促進乳腺癌進程。BACH 1的下調可能是由于血紅素水平升高促使HO-1分解血紅素而減少細胞凋亡[8,9]。HO-1是一種細胞保護酶,HO-1在多種腫瘤組織中高表達,包括乳腺癌、鼻咽癌和胃癌等[10,11],這與我們的研究結果一致,證明BACH 1低表達與HO-1高表達參與了乳腺癌的進程。

乳腺癌的治療通常采用手術及術后的放、化療等,通常容易復發和轉移,中藥以副作用小、價格低廉為患者提供了希望。丹皮酚是牡丹皮中的有效成分,具有抑制乳腺癌細胞生長的作用。本研究結果顯示,丹皮酚能誘導細胞凋亡,細胞出現明顯的凋亡形態學改變與凋亡指數的增加,并使低表達的BACH 1升高,高表達的HO-1降低,進一步證明了丹皮酚的抗乳腺癌的作用是通過誘導細胞凋亡,并且與調控BACH 1、HO-1相關,為以BACH 1、HO-1為靶點治療乳腺癌提供了新思路。