鉤吻總堿誘導慢性粒細胞白血病K562細胞凋亡的機制分析

王文義,檀興慧,盧伊,李德森,吳水生

(1.福建中醫藥大學科技創新與轉化中心,福建 福州 350122;2.福建中醫藥大學藥學院,福建 福州 350122;3.都昌縣中醫院,江西 九江 332600)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)為骨髓增生性腫瘤,美國CML的患病率2022年約為15萬例以上,早期預估到2030—2040年,CML患病率將約達18萬例,全球CML患病率可達1 000萬例以上[1],可見白血病治療藥物的研發格外迫切。在關于白血病的研究中發現白血病主要是由于費城染色體中9號染色體的延長和22號染色體的縮短而促發染色體相互易位,在細胞遺傳學及分子生物學水平上表現出CML細胞因基因易位出現BCR-ABL融合基因,該基因表達出一種具有絡氨酸激酶活性新的癌蛋白P210BCR-ABL[2],引起下游信號通路RAS、RAF、JUN等的異常激活,導致細胞周期異常、成熟障礙、分化受阻、增生活躍,進而促進CML細胞的存活和生長。因此,白血病藥物研發多圍繞BCR-ABL融合基因展開,例如:BCR-ABL靶向蛋白激酶抑制劑伊馬替尼、TKIs等[3],但伊馬替尼耐藥和TKIs對T315I突變體的抑制效果都不理想。而由于BCR-ABL在正常細胞中無表達,選擇性降解BCR-ABL是治療CML更理想和更安全的策略[4]。由于天然產物無或少副作用,因此成為癌癥和傳染病藥物開發的寶貴來源。生物堿、類黃酮、萜類和多糖類等一系列天然產物在治療CML中表現出抗BCR-ABL的生物活性,例如高三尖杉酯堿[5]、粉防己堿[6]、姜黃素[7]等。眾所周知,在白血病的臨床治療中,化學治療居于主導地位,中西醫結合治療亦不少見,尤以砷劑治療急性早幼粒細胞白血病備受矚目[8]。

中醫學認為癌病的發病機制為正氣虧虛,加之氣、血、痰、濕、熱毒相互搏結,日久結聚為癌。根據白血病的臨床癥狀可歸于“虛勞”“溫病”“血證”等范疇。中醫學認為此病位為骨髓,病變臟腑在腎,病機關鍵為本虛標實,虛實夾雜。鉤吻,又名苦吻、斷腸草等,始載于《神農本草經》,性溫,味辛、苦;有大毒,具有攻毒散結,消腫止痛的功效。現代藥理學研究表明鉤吻具有抗腫瘤[9-10]、消炎鎮痛[11]、調節免疫[12]等作用。基于現代醫學及中醫學的認識,鉤吻具有治療白血病的潛力,但尚未見相關報道。本研究以慢性粒細胞白血病細胞株K562為細胞模型,以鉤吻總堿(total alkaloids ofGelsemiumelegans,TAG)為研究對象,利用MTT法檢測TAG對慢性粒細胞白血病K562細胞活力的影響,分析其量效-時效關系,通過熒光倒置相差顯微鏡觀察、DAPI熒光染料染色、流式細胞術Annexin V/PI雙染料實驗、比色法、RT-PCR等方法探討TAG影響慢性粒細胞白血病細胞K562細胞活力的分子機制,旨在為鉤吻防治慢性髓系白血病的應用提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器HF212 UV型CO2培養箱(力康生物醫療科技控股有限公司);Multiskan FC型酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司];IX70熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司);KQ-500DE型數字超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司);5424R型低溫高速離心機(德國Eppendorf 公司);5331型PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗試劑MTT(批號:88417,美國Sigma公司);0.25%胰蛋白酶(批號:2048080)、胎牛血清(FBS,批號:1982158C)、IMDM培養基(批號:8122238)、青鏈霉素(批號:2019313)均購自美國Gibco公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號:MA0220-1,大連美倫生物技術公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,批號:PB189327,武漢普諾賽生命科技有限公司);逆轉錄試劑盒(批號:K1691)、PCR Mix(批號:K0172)均購自美國Thermo 公司;Caspase-3 分光光度法檢測試劑盒(批號:KGA202,江蘇凱基生物技術股份有限公司);Trizol(批號:R401-01,南京諾唯贊生物科技股份有限公司);BCA蛋白定量分析試劑盒(批號:P0012)、DEPC水(批號:R0021)均購自上海碧云天生物技術有限公司;無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷等化學試劑均為分析純。

1.3 實驗細胞人慢性粒細胞白血病細胞株K562,由中國科學院細胞庫提供。

1.4 實驗藥物及制備鉤吻總堿為福建中醫藥大學藥學院中藥萃取中心提取、純化制備,提取率約為0.60%。取適量TAG用二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為400 mg·mL-1的母液,于-20 ℃保存,給藥時以含有10%胎牛血清(FBS)的IMDM培養基稀釋成相應濃度。

2 實驗方法

2.1 細胞培養人慢性粒細胞白血病K562細胞以含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的IMDM完全培養基,在37 ℃,5% CO2環境中培養,2～3 d傳代1次。

2.2 鉤吻總堿對K562 細胞活力的影響取對數生長期的K562細胞,計數后用IMDM完全培養基調整細胞密度為1×105mL-1,接種于96孔培養板中(100 μL/孔),置37 ℃,5% CO2培養24 h;將細胞分為:空白組(等體積完全培養基)、TAG組(25、50、100、200、400 μg·mL-1),每組復孔6個;分別干預12、24、48 h后,每孔加入20 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液培養4 h,加入100 μL DMSO溶液溶解結晶,在570 nm處測定各孔吸光度值,計算12、24、48 h時IC50,實驗平行重復3次。

2.3 TAG對K562細胞形態的影響取對數生長期K562細胞,調整細胞密度為1×105mL-1,接種于6孔板(每孔2 mL)培養24 h。細胞分為空白組(等體積完全培養基)、TAG組(50、100、200 μg·mL-1)(濃度設置根據TAG的MTT結果計算出TAG干預K562細胞24 h時IC50為122 μg·mL-1),藥物干預24 h后在顯微鏡下觀察K562 細胞形態的改變。

2.4 DAPI染色觀察TAG對K562細胞凋亡的影響取對數生長期的K562細胞,調整細胞密度為1×105mL-1,接種于6孔板(2 mL/孔),培養24 h,細胞分為空白組(等體積完全培養基)和TAG組(50、100、200 μg·mL-1),各孔給予相應藥物后培養24 h,1 000 r·min-1離心5 min收集細胞,加入500 μL DAPI工作液(濃度為2 μg·mL-1,甲醇稀釋)進行染色,再次離心收集細胞,加入500 μL的Buffer A重懸細胞,吸取100 μL各濃度組 Buffer A置于24孔板中,搖勻使細胞成一個細胞平面,熒光倒置相差顯微鏡下觀察并拍照,實驗平行重復3次。

2.5 流式細胞術Annexin V/PI雙染料實驗觀察TAG干預K562細胞后的凋亡情況將細胞密度為1×105mL-1的對數期細胞K562,以2 mL/孔接種于6孔板培養24 h,細胞分為空白組(等體積完全培養基)和TAG組(50、100、200 μg·mL-1),各孔給予相應藥物后培養24 h,1 000 r·min-1離心5 min,棄去上清,加入500 μL PBS,吹打混勻后,以1 000 r·min-1離心5 min收集各濃度組細胞,重復2次,加入500 μL的Binding Buffer重懸細胞,將重懸液轉移至流式細胞管中,分別加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI混勻,室溫避光反應5 min,通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,實驗平行重復3次。

2.6 分光光度法檢測TAG誘導K562細胞凋亡caspase-3活性變化將密度為 4×105mL-1的對數期K562細胞,以2 mL/孔接種6孔板并培養24 h后,空白組加入等體積完全培養基,TAG組分別加入2 mL的含藥培養基(50、100、200 μg·mL-1)干預24 h,消化離心收集各組細胞,PBS洗滌細胞,1 000 r·min-1離心5 min,收集細胞,重復洗滌1次;往細胞沉淀中加50 μL預冷的工作液A(247.5 μL Lysis Buffer+2.5 μL DTT),反復吹打混勻,將各組細胞置于冰上30 min 使其充分裂解,4 ℃ 12 000 r·min-1離心 15 min,采用BCA法酶標儀上570 nm處檢測吸光度值,計算出各組蛋白濃度(mg·mL-1)。

依照BCA法測得的各藥物組蛋白濃度情況,取總質量為150 μg的蛋白溶液(體積為50 μL,若體積不足,則用Lysis Buffer補足),將提取的各組蛋白溶液滴加于96孔板中,每孔加入含 0.5 μL DTT 的 50 μL 2×Reaction Buffer 后,再加入 5 μL caspase-3 Substrate,混勻后于培養箱反應 4 h,405 nm 測定其吸光度,計算caspase-3活性倍比關系。

A=OD濃度組-OD調零組
Caspase倍比=A濃度組/A空白組

2.7 RT-PCR方法檢測TAG誘導K562細胞Bax和Bcl-2凋亡基因表達情況各組藥物干預后棄取上清后,通過Trizol提取、三氯甲烷沉淀后以12 000 r·min-1離心15 min,取最上層無色水相為RNA,加入500 μL異丙醇沉淀RNA,以12 000 r·min-1離心10 min棄去上清,75%乙醇洗2次沉淀,7 500 r·min-1離心5 min,棄上清,揮干乙醇,加入20 μL DEPC水溶解 RNA。在核酸檢測儀上采用Nano-Drop 2000軟件檢測各濃度組所提RNA的濃度、OD260/OD280比值,根據逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA;引物由上海申工公司合成,具體見表1;逆轉錄程序(20 μL反應體系)見表2。DNA瓊脂糖凝膠電泳,電泳完成后將膠移至凝膠成像系統觀察最終結果。

表1 引物設計堿基序列

表2 逆轉錄程序

3 實驗結果

3.1 TAG對K562細胞活力的影響慢性粒細胞白血病K562細胞對各濃度TAG均有敏感性,并且隨著作用時間的延長和藥物濃度的加大,K562細胞活力明顯下降,呈現出明顯的量效-時效關系。根據實驗數據,計算出TAG干預24 h后K562細胞活力下降50%的IC50為122 μg·mL-1,結果見表3。

表3 不同濃度鉤吻總堿對 K562細胞增殖的影響

3.2 倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度TAG干預后K562細胞形態的變化正常K562細胞體積較大,呈圓形或橢圓形串珠樣排列,個別細胞散在分布。細胞生長穩定,細胞膜完整,細胞質均勻透亮折光性佳,并且該組細胞在鏡下因染色質細膩分布疏松呈現出胞核大、胞質少;TAG處理K562細胞24 h后,細胞體積縮小,形態不規則呈梭形或伸出多個偽足,胞質不清折光性差。隨著藥物濃度的增大,鏡下細胞逐漸減少分布越見松散,細胞狀態越來越差,圓形細胞核變形呈半月形改變,染色質粗糙凝聚縮小,部分細胞內出現空泡(見圖1)。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度鉤吻總堿作用24 h 后對K562細胞的影響(×100,n=3)

3.3 熒光顯微鏡觀察TAG對K562細胞形態的影響未經鉤吻總堿處理的細胞邊界形態清晰,細胞膜完整,細胞核膜光滑,細胞核質均勻圓潤且染色呈均一藍色。干預鉤吻總堿后細胞的正常形態消失,表現出典型的凋亡形態改變,凋亡細胞體積縮小,細胞核染色質固縮呈波浪狀,甚至密集聚集結構成團塊狀,細胞核深染(見圖2)。隨著TAG作用濃度的加大上述狀態細胞越多,有明顯的量效關系。

圖2 熒光倒置相差顯微鏡觀察不同濃度鉤吻總堿作用24 h后對K562細胞的影響(×200,n=3)

3.4 Annexin V/PI 流式細胞術測定不同濃度TAG對 K562 細胞凋亡影響經不同濃度TAG(50、100、200 μg·mL-1)干預的K562細胞凋亡率顯著高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05),隨著TAG作用濃度的升高正常細胞數越少,凋亡和死細胞越多,存在劑量依賴關系,結果見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測不同濃度鉤吻總堿作用K562細胞24 h流式圖(n=3) 注:與空白組對比,*P<0.05,**P<0.01。

3.5 紫外分光光度法檢測caspase-3 蛋白活性藥物組的TAG干預慢性粒細胞白血病K562細胞24 h后,各藥物組caspase-3 酶活性與空白組比較均提高,并且隨著TAG藥物劑量的增大而增強,顯示出明顯的劑量依賴,結果見圖4。

圖4 各濃度組鉤吻總堿作用K562細胞24 h caspase-3蛋白表達變化 注:與空白組對比,**P<0.01。

3.6 TAG對 K562 細胞內線粒體途徑凋亡基因 Bax 和 Bcl-2的影響在本實驗中檢測TAG作用 K562 細胞 24 h 后 Bax 和 Bcl-2基因表達情況,結果表明TAG可上調Bax、下調 Bcl-2基因表達引發 K562 細胞凋亡,并隨著藥物濃度的增加,效應越強,結果見圖5。

圖5 各濃度組鉤吻總堿作用K562 細胞Bax和 Bcl-2 mRNA 表達水平 注:與空白組對比,*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

白血病在我國惡性腫瘤的發病率和死亡率中持續上升,對人類的生命健康構成嚴重威脅,目前尚無特效的治療藥物。因此尋找治療白血病的新藥成了治療白血病的重點。鉤吻總生物堿是鉤吻主要毒性成分,亦是活性成分,對肝癌、結腸癌、肺癌等良好的治療效果[13-15]。王寅等[16-18]對TAG的體外研究提示其抗腫瘤作用可能是通過細胞凋亡途徑實現的,表現為增加腫瘤細胞對射線的敏感性,效用同放射增敏劑或阻滯細胞周期等。黃蘭青等[19-20]的體內研究結果表明TAG對鼠類造血有保護作用。提示鉤吻是潛在的白血病治療藥物,值得深入探討。

研究發現在12 h、50 μg·mL-1處即發生抑制,抑制率為1.67%±1.09%,當TAG濃度達到400 μg·mL-1、48 h時,對K562細胞的抑制率達95.6%±1.08%,呈現出一定的時效-量效關系;DAPI染色結果顯示TAG干預后細胞核固縮,細胞表現為凋亡形態,隨濃度增加該形態核改變細胞越多,說明TAG抑制K562細胞方式可能為誘導K562細胞凋亡。為了進一步說明佐證上述觀點,本研究進一步采用Annexin V/PI熒光雙染流式細胞術觀察TAG作用K562細胞24 h后流式圖分布,可見隨著藥物劑量的增加,代表細胞早凋分布區的散點越多,有明顯的劑量依賴,表明TAG通過誘導細胞凋亡發揮抗白血病K562細胞增殖的作用。細胞凋亡是一種由基因控制的程序性細胞死亡[21]。Caspase 家族中的蛋白質介導了幾乎所有的細胞凋亡通路,是凋亡信號轉導過程中的關鍵因子,caspase-3 是細胞凋亡通路中的下游蛋白,酶原形式能被caspase-8、caspase-9、caspase-10 激活,是細胞凋亡執行期的主要執行者,是各凋亡通路的交匯點,本研究通過caspase-3 分光光度法檢測不同濃度TAG作用K562細胞 24 h后 caspase-3的活性,發現TAG作用后 K562 細胞的caspase-3 活性提高呈現出明顯的劑量關系,推測caspase-3參與了TAG誘導K562細胞凋亡。Bcl-2 家族是細胞凋亡過程的重要參與者,參與線粒體途徑,作用的主要部位是線粒體外膜[22]。Pepper等[23]提出Bcl-2/Bax的比值的高低是決定細胞命運的分子開關。因此,誘導腫瘤細胞中Bax表達上升、Bcl-2表達下降,促進腫瘤細胞凋亡,是抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細胞作用的關鍵機制之一。本研究以Bax和Bcl-2為目標基因,采用RT-PCR的方法檢測不同濃度TAG作用24 h后二者的表達情況,發現Bax基因隨著藥物濃度的加大表達量也加大、Bcl-2 基因隨著藥物濃度的加大表達量逐漸降低,提示TAG誘導K562細胞凋亡是通過上調 Bax 基因、下調 Bcl-2 實現的。本研究初步闡明TAG可能通過線粒體途徑,改變 Bax和Bcl-2基因的表達情況,激活通路下游的蛋白caspase-3,最終活化的caspase-3調控了K562細胞凋亡。但在本研究水平,未采用正常細胞進行對照實驗,無法說明安全性問題;但本研究揭示了鉤吻生物堿抗白血病的潛在作用,為其進一步的抗白血病的物質基礎研究以及相關單體成分的挖掘提供基礎。在此基礎上,下一步課題組將圍繞鉤吻生物堿抗白血病的物質基礎及分子機制開展深入研究,為抗白血病藥物研發提供科學依據。