氯沙坦鉀原料藥降解途徑與降解雜質分析

潘靜,夏佳璇,金一寶,湯佳,王冰,黃曉龍

(1.國家藥品監督管理局藥品審評檢查大灣區分中心,廣東 深圳 518017;2.深圳市藥品檢驗研究院,國家藥品監督管理局仿制藥評價生物等效性研究重點實驗室,深圳市藥品質量標準研究重點實驗室,廣東 深圳 518057;3.中山大學藥學院<深圳>,廣東 深圳 518107)

氯沙坦鉀(losartan potassium)作為首個臨床非肽類血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑,屬于沙坦類藥物,具有安全性高的特點,可同其他抗高血壓藥物一起使用,本品耐受性良好,不良反應輕微且短暫[1],臨床上被廣泛應用。2021年統計數據顯示中國地區含氯沙坦鉀活性成分藥物制劑的銷售額已達6.219 5億元[2]。

原料藥作為藥品的主要活性成分,藥物的有效性和安全性與原料藥密切相關,藥物因原料藥生產、制劑過程中原料藥與輔料發生化學反應及儲存不當等因素均可能產生雜質從而降低藥品活性,影響藥物穩定性;甚至因各種原因產生的基因毒性雜質,會對人體健康產生嚴重的副作用和不良反應。如纈沙坦類產品中發現的N-二甲基亞硝胺及其他亞硝胺類基因毒性雜質[3-4],其來源于活性藥物成分合成中產生,但也有研究表明沙坦類藥物雜質來源于生產、貯存和運輸等外部因素[5-6]。有研究將氯沙坦鉀置于紫外、氧化及光照下對降解樣本分析,發現樣本具有慢性或急性毒性[7]。強制降解試驗即在較短時間內采用劇烈條件使藥物產生一定水平的降解[8],從而快速獲取降解途徑和降解產物,為藥物安全性研究提供支持,以及對有關物質分析方法的開發,藥物處方、包裝材料選擇和儲存條件提供支持[9]。

本文依據人用藥品技術要求國際協調理事會(ICH)指導原則等[10-12]開展氯沙坦鉀原料藥在氧化、強酸、強堿、高溫、光照條件下的強制降解試驗,開發基于高效液相色譜儀的分析方法,為氯沙坦鉀原料藥的降解途徑和有關物質的研究奠定基礎,為原料藥的儲存、制劑工藝、藥品生產、運輸和貯存條件提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司);X500R UHPLC-Q TOF液質連用儀(美國Sciex公司);XS 105 DU天平(瑞士Mettler Toledo公司);BT 25S天平(德國Sartorius公司);HS3120超聲儀(天津恒奧科技發展有限公司);SW23水浴鍋(德國Julabo公司);KBF240恒溫恒濕箱(德國Binder公司);UN110恒溫干燥箱(德國Memmert公司)。

1.2 試劑試藥氯沙坦鉀原料藥(浙江華海藥業股份有限公司,批號:C5663-22-011);氯沙坦鉀對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:100597-201703);《歐洲藥典》氯沙坦雜質L(批號:LSTJ-12052019)、《歐洲藥典》氯沙坦雜質M(批號:LSTJ-05262020)、氯沙坦雜質1(N-[[2′-(2H-tetrazol-5-yl)[1,1′-biphenyl]-4-yl]methyl]pentanamide,批號:LSTJ-05182020)均購于深圳市宏盛生物技術有限公司。乙腈(北京百靈威科技有限公司,色譜級);氫氧化鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,分析純);磷酸、鹽酸和30%過氧化氫(廣東廣試試劑科技有限公司,分析純);超純水由Millipore超純水儀自制。

2 方法與結果

2.1 液相色譜條件Waters XBridge BEH C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,柱溫30 ℃,流動相A為0.05%磷酸水溶液,流動相B為乙腈,流速1.0 mL·min-1,按照表1程序梯度洗脫,進樣量10 μL,檢測波長210 nm。

表1 液相梯度洗脫程序

2.2 液質檢測條件Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,柱溫35 ℃,流動相A為5 mol·L-1乙酸銨(pH=4),流動相B為乙腈,流速0.5 mL·min-1,按照表2程序梯度洗脫。質譜信號采集時間0～20 min,電噴霧離子源,正離子模式,信息依賴采集(IDA)掃描模式。離子噴霧電壓5 500 V,離子源溫度500 ℃,去簇電壓(DP) 80 V,霧化氣和輔助氣均為55 psi氮氣,35 psi氮氣作氣簾氣。掃描范圍m/z50～1 000 Da,碰撞能(CE) 10 V。MS/MS掃描范圍m/z50～1 000 Da,碰撞能(CE) 30 V。

表2 液質聯用梯度洗脫程序

表3 氯沙坦鉀降解產物及降解途徑

2.3 溶液的制備稀釋劑:乙腈-水(2∶8)。

供試品溶液:精密稱取氯沙坦鉀原料藥12.5 mg,置于25 mL容量瓶,加稀釋劑溶解并稀釋制得0.5 mg·mL-1溶液,過濾,取續濾液作為供試品溶液。

對照品溶液:臨用前將氯沙坦鉀對照品于烘箱105 ℃烘干2 h,精密稱取5 mg氯沙坦鉀對照品,加稀釋劑于2.5 mL容量瓶定容,作為對照品儲備液;用稀釋劑按比例稀釋使用。

2.4 強制降解試驗

2.4.1 氧化破壞室溫環境下,精密稱取氯沙坦鉀原料藥10 mg,置于玻璃具塞試管中,分別加入500 μL不同濃度的過氧化氫溶液(0、0.1%、3.0%、10%、30%),于室溫下放置24、48、72、168 h后,加稀釋劑定容至20 mL,搖勻后過濾(0.22 μm尼龍濾膜),取續濾液檢測。精密稱取氯沙坦鉀原料藥10 mg,分別加入500 μL不同濃度H2O2溶液(0、0.1%、1.0%、3.0%、10%、20%、30%),置于60 ℃水浴[13]中反應1、3 h,冷卻后加稀釋劑同法操作檢測。

2.4.2 酸破壞精密稱取氯沙坦鉀原料藥10 mg,置于玻璃具塞試管中,加入500 μL不同濃度鹽酸溶液(0、1、2 mol·L-1),分別于60 ℃反應3、6 h及室溫反應8 h。分別加500 μL對應濃度的氫氧化鈉溶液中和,加稀釋劑同法操作檢測。

2.4.3 堿破壞精密稱取氯沙坦鉀原料藥10 mg,置于玻璃具塞試管中,分別加入500 μL不同濃度氫氧化鈉溶液(0、2、4 mol·L-1),分別于60 ℃反應3、6 h及室溫反應8 h。分別加500 μL對應濃度鹽酸溶液中和,加稀釋劑同法操作檢測。

2.4.4 高溫破壞固體狀態下,取氯沙坦鉀原料藥平鋪于玻璃培養皿中(厚度<1 mm),置烘箱105 ℃加熱6、12、24 h后,充分混勻后精密稱取10 mg,加稀釋劑同法操作檢測。濕度考察,取氯沙坦鉀原料藥10 mg,置恒溫恒濕箱中(55 ℃,RH 92.5%),放置24、72、120 h,加稀釋劑同法操作檢測。另取氯沙坦鉀原料藥10 mg,置恒溫恒濕箱中(92.5 ℃,RH 25%),放置0.25、1、2 h后,加稀釋劑同法操作檢測。溶液狀態下,稱取氯沙坦鉀原料藥10 mg于10 mL離心管中,加稀釋劑1.0 mL,水浴90 ℃加熱破壞3、12、24 h,加稀釋劑同法操作檢測。

2.4.5 光照破壞取氯沙坦鉀原料藥平鋪于玻璃培養皿中(厚度<1 mm),置恒溫恒濕箱(25 ℃,RH 25%),(4 500±500) Lx白光,照射1、10、30 d,混勻精密稱取10 mg,加稀釋劑同法操作檢測。另稱取氯沙坦鉀原料藥10 mg于離心管中,加稀釋劑1.0 mL,在(4 500±500) Lx照射1、7、20 d,加稀釋劑同法操作檢測。

2.5 降解試驗結果

2.5.1 氧化破壞氯沙坦鉀原料藥在氧化(室溫和加熱)環境下均會發生不同程度的降解,1% H2O2(加熱)環境中已出現降解產物,但其峰面積小于0.1%,在高于3% H2O2氧化破壞下,室溫和加熱環境均會發生降解。室溫環境,氯沙坦鉀的降解率和降解產物個數隨H2O2濃度增加而增加;同濃度條件下,降解率和產物數隨放置時間增加而增加。當氧化破壞伴隨著高溫環境(60 ℃),短時間內降解率可超過10%,伴隨H2O2濃度的增加及時間的延長,最高降解率可達53.05%,產生29個降解產物。

2.5.2 酸破壞氯沙坦鉀在酸室溫條件下,最高降解率為4.84%。在酸伴隨加熱環境下,降解率在16.49%～37.97%,說明氯沙坦鉀在酸降解中受溫度影響大,溫度越高其降解越明顯。氯沙坦鉀在2 mol·L-1鹽酸中降解率低于1 mol·L-1鹽酸,推測可能因氯沙坦鉀在酸性環境中溶解度下降[13]所致。同濃度酸條件下加熱時長對氯沙坦鉀的降解影響不大,但降解產物稍有差異,相對保留時間(RRT) 2.20和2.29這兩個降解產物相對含量隨降解條件(酸濃度和時長)增強而增加。

2.5.3 堿破壞氯沙坦鉀在堿室溫環境微弱降解,RRT 0.136處的降解產物的相對含量隨著堿濃度的增加而降低,推測因氯沙坦鉀在堿環境中溶解度差異所致。另2 mol·L-1氫氧化鈉比4 mol·L-1氫氧化鈉新產生了RRT為2.20和2.29兩個降解產物,與酸破壞中顯著增加的降解產物一致,但在堿破壞中僅占0.2%左右,遠低于酸環境。同濃度堿環境下加熱時長對降解率影響不大。初步判定氯沙坦鉀對堿性環境相對穩定。

2.5.4 高溫破壞《中國藥典》2020年版(二部)和相關文獻[11,15]表明,氯沙坦鉀原料藥易吸潮,顆粒烘干后應立即壓片,故分別考察氯沙坦鉀在固體和液體狀態下的高溫破壞。氯沙坦鉀原料藥在固體高溫干燥(烘箱105 ℃)環境12 h和高溫低濕(92.5 ℃,RH 25%)環境2 h內穩定性良好。但在固體高溫高濕環境(55 ℃,RH 92.5%)3 d降解率可超30%,第5天降解率達43.97%,但基于HPLC的紫外檢測,只有4個降解產物(相對含量最高的僅為0.39%),推測其降解產物不具有紫外吸收。氯沙坦鉀在溶液狀態于高溫水浴90 ℃環境24 h后降解率為7.36%,RRT 2.20和RRT 2.29這2個降解產物含量均隨時間的延長而增加。

2.5.5 光照破壞考察氯沙坦鉀在固體和溶液狀態下對白光[25 ℃,RH 25%,(4 500±500) Lx]的敏感性,氯沙坦鉀原料藥在固體狀態下10 d降解率可超10%,光照30 d降解產物數有4個,其中RRT 2.38降解產物含量隨時間的延長而增加。氯沙坦鉀溶液狀態對光照敏感,僅1 d降解率達5.54%,20 d降解率達47.26%,產生8個降解產物。其中RRT 1.46在固體和溶液狀態下含量均會隨時間的延長而增加。

2.6 氯沙坦鉀降解途徑以氯沙坦鉀降解率和峰面積大于主峰0.1%的降解產物個數進行比較,將67種降解條件下的降解率和降解產物個數作氣泡圖(見圖1)。對氯沙坦鉀原料藥在氧化、酸、堿、高溫和光照條件下的降解率進行總結。氯沙坦鉀在氧化(室溫和加熱)環境中均呈現極大的降解率,H2O2濃度、氧化環境溫度以及氧化時長均有影響。在酸破壞環境中降解率受溫度影響大,酸加熱環境的降解率遠高于其在室溫環境的降解率。雖然堿環境相對穩定,但其降解同樣受溫度影響,堿加熱環境中降解率有所增加。高溫高濕環境下降解率也遠高于高溫干燥環境。一旦配制成為溶液狀態,光照條件下降解率急劇上升。

圖1 氯沙坦鉀原料藥在67種降解條件下的降解率和降解產物氣泡圖

2.7 氯沙坦鉀降解產物分析氯沙坦鉀原料藥在多種強制破壞條件下均產生了22種降解產物(峰面積>0.1%氯沙坦鉀峰面積,見圖2),結合液質聯用對氯沙坦鉀的母核結構和碎片分子量以及降解雜質的二級斷裂碎片的測定結果,推測了降解產物中的19種化合物的分子量和分子式,確定了峰1、8、19和20這4個降解雜質的分子結構。

圖2 氯沙坦鉀各降解條件下的降解產物色譜圖

在氧化破壞中,峰1峰面積為主峰(氯沙坦鉀)峰面積的3倍左右(見表1),如圖3所示,在正離子模式下,峰1的一級質譜(MS1)提示503.242 4、252.125 1、235.097 5、207.091 3,503.242 4可能為其準分子離子,對m/z503.242 4、252.125 1、235.097 5、207.091 3分別進行二級碎片采集,發現m/z252.125 1的碎片中,含有m/z235.097 5、207.091 3,結合m/z503.242 4可能為[2M+H]+,判定[M+H]+準分子離子峰為m/z252.125 1,二級質譜(MS2)提示[M+H]+脫去-NH3后,形成m/z235.098 0的[M+H-NH3]+,隨后四氮唑環斷裂離去N2,與苯成環結合成苯并吡唑形成m/z207.092 0,吡唑環進一步斷裂形成m/z180.079 5碎片離子。

圖3 RRT 0.140降解雜質質譜裂解

峰8同樣作為氧化降解產物,如圖4所示,在正離子模式下,其MS1顯示[M+H]+準分子離子峰m/z336.180 9,MS2含有235.096 1、207.089 3,提示其母核與峰1均含有四氮唑聯苯結構,且根據氯原子的質譜規律,峰1和峰8中均不含Cl原子。氯沙坦鉀結構包括咪唑環、聯苯以及四氮唑3部分,結合降解產物的碎片離子,認為在氧化條件下O=O最先進攻氯沙坦鉀的咪唑環,Cl原子離去同時保留聯苯和四氮唑部分,初步推斷咪唑環在氧的進攻下斷裂,發生1,4-環加成,離去-N=C-Cl形成化合物峰8分子式C19H21N5O(分子量335.17);峰1是峰8離去烷基支鏈后進一步的氧化降解產物,分子式C14H13N5(分子量251.12)。文獻[16]表明,氯沙坦鉀的咪唑環易發生單線態氧的光敏化反應,在氯沙坦鉀的氧化混懸液中也發現了這兩個成分。將其與對照品比對后證實峰1為(2′-(1H-tetrazol-5-yl)-[1,1′-biphenyl]-4-yl)methanamine,峰8為N-[[2′-(2H-tetrazol-5-yl)[1,1′-biphenyl]-4-yl]methyl]pentanamide,是纈沙坦去纈氨酸雜質。

圖4 RRT 0.87降解雜質質譜裂解

峰19和20這兩個降解產物在酸中的顯著增加(峰面積占比達到了9.84%),在正離子模式下,峰19和峰20的MS1分別為827.319 3和827.321 5,MS2有809.305 4、405.155 1、377.150 5和207.090 5且豐度高,氯沙坦鉀在酸性環境下其咪唑環會發生斷裂[17],結合離子碎片初步判斷兩者為同分異構體,[M+H]+準分子離子峰為m/z827.32。通過對照品比對保留時間和二級碎片確認為《歐洲藥典》(EP)收載的雜質L和雜質M(見圖5～6)。

圖5 RRT 2.21降解雜質質譜裂解

圖6 RRT 2.29降解雜質質譜裂解

3 討論

3.1 降解條件的選擇基于ICH指導原則[10,18]設計了本實驗的降解條件,如30%過氧化氫在超過60 ℃[12,19]的條件下分解速度會顯著增加故選擇了60 ℃作為氧化加熱降解條件,聯合氧化室溫條件以考察緩慢氧化對降解的影響。文獻[14]表明氯沙坦鉀在酸性環境中會發生降解,故設置了高于常規考察的鹽酸濃度2 mol·L-1和1 mol·L-1;未見有文獻報道其在堿環境中的穩定性,故設置了高濃度的氫氧化鈉4 mol·L-1和2 mol·L-1。高溫降解試驗根據應用,分別考察了其在固體狀態下高溫低濕、高溫高濕、高溫干燥以及溶液狀態下高溫水浴4種條件。

3.2 氯沙坦鉀降解途徑基于氧化、酸、堿、高溫以及光照強制降解實驗結果,氯沙坦鉀對氧化、酸、高溫和光照環境敏感。在氧化環境中降解率最高(77.94%),后依次是光照(47.26%)、高溫(43.97%)和酸破壞(37.97%)。氧化環境中產生的降解產物最多為57個,其次是酸降解有23個。結合氯沙坦鉀和降解雜質的碎片離子,初步得出以下的裂解規律,具有氯沙坦鉀母核結構的雜質會產生m/z405、377、235、207、190碎片離子峰;咪唑環片斷和聯苯片斷與四氮唑環片斷容易斷裂,產生碎片離子,MS有207和235時提示含聯苯并四氮唑結構;咪唑環和四氮唑連接的基團容易斷裂,可據此推斷咪唑環和四氮唑上的取代基團。基于此裂解規律,我們對降解產物中的22種成分進行了結構解析,確定了峰1、8、19和20 4個化合物的結構,總結了峰1和峰8這兩個氧化降解雜質的裂解規律。氯沙坦鉀結構中咪唑環上的Cl原子易受到氧化離子的攻擊,咪唑環斷裂的同時,N原子幫助結構的重排,而產生氧化降解產物。此外,咪唑環對熱和光照環境不穩定,氯沙坦鉀的咪唑環上連接的Cl原子和-CH2OH可能是氯沙坦鉀在溶液中對光和高熱不穩定的原因之一。四氮唑是羧基的生物電子等排體,與羧基具有十分相似的理化性質,具有較強的酸性,但與聯苯結構可形成較穩定的復合物,推測可能是其對堿相對穩定的原因。

氯沙坦鉀的降解途徑主要為氧化破壞、酸破壞和溶液高溫破壞,同時因其易吸潮的特性,固體狀態下高溫伴隨高濕環境、溶液狀態下白光(25 ℃,RH 25%)照射也存在顯著降解。因此,在氯沙坦鉀原料藥產品包裝儲存及藥物制劑處方設定時應避免接觸氧化劑及酸,其常規制劑工藝也宜采用粉末直壓、干法制粒等,同時需控制環境溫、濕度及避免強光。通過對氯沙坦鉀降解途徑的研究,有助于探索藥品貯藏及藥品制劑生產中的雜質變化,用于氯沙坦鉀原料藥及其制劑的質量控制。

4 結論

本試驗建立了一種在各種降解條件下能有效分離氯沙坦鉀和其降解雜質的HPLC分析方法,經方法學驗證此分析方法穩定可靠。考察了氧化、酸、堿、高溫、光照5大類強制降解條件對氯沙坦鉀原料藥的影響,共設計67種降解條件,明確了氯沙坦鉀的降解途徑主要為氧化破壞、酸破壞和固體高溫高濕破壞,溶液高溫以及溶液白光破壞。本研究可為氯沙坦鉀原料藥的質量控制尤其是有關物質的研究提供參考,也可為氯沙坦鉀原料藥的貯藏及制劑工藝研究提供參考依據。