阿侖膦酸鈉脂質體的制備及透皮給藥性能評價

張廣儒,孫倩倩,呂美,王利濤

(1.山東第二醫科大學藥學院,山東 濰坊 261053;2.濟寧醫學院藥學院,山東 日照 276826)

阿侖膦酸鈉(ALN)是一種雙膦酸鹽類藥物常用于治療老年和絕經后骨質疏松癥,其機制基于抗骨吸收活性,減少破骨細胞數量,是一種有效的骨吸收抑制劑[1],在臨床應用方面對髖骨骨折的治療尤為顯著,同時還具有抗高血脂和保肝作用[2]。當前抗骨質疏松藥物主要通過口服和注射兩種給藥方式[3],但ALN口服利用度低,注射給藥依從性差。因此,對于創造藥物新劑型去增強藥物利用效率的需求一直在增加[4],透皮給藥是一種無創給藥的新途徑,能夠減輕藥物在體內引起的不良反應和副作用,提高藥物的利用度[5],因此可采用透皮給藥的方式來實現藥物的高效利用。

透皮給藥具有控釋、延長治療周期等諸多優點,是一種極具發展潛力的藥物遞送方法[6]。但如何克服皮膚角質層的屏障,進一步加強對皮膚的滲透是透皮給藥面臨的主要挑戰,當前主要的促滲方法分為3類:第1類使用化學促滲劑類,如二醇、鏈烷醇、萜烯類等[7];第2類物理促滲技術類,如電穿孔、微針、離子電滲療法[8];但化學促滲劑法對皮膚有一定的刺激性,物理促滲技術價格昂貴,患者的依從性差,第3類也是應用最為廣泛的納米載體類[9],如脂質體、微乳等通過溶解皮脂和角質層的水合作用來改變皮膚屏障,該法對皮膚表面刺激性小,且價格低廉。在納米載體類促滲方法中最常使用的載體是脂質體,脂質體(liposomes)是應用最廣泛的藥物輸送系統,也是最早的透皮載體[10],長期以來一直被用作親水和水性藥物的首選遞送系統[11]。其主要作用機制可與皮膚角質層的磷脂相互作用,增加藥物滲透效率[12],在真皮和透皮藥物遞送方面具有潛在價值[13]。因此,本試驗利用透皮給藥中脂質體劑型的特點,去實現ALN在皮膚中高效滲透,并成功制備了一種含ALN的脂質體,考察了其透皮性能,證明了該脂質體可以達到高效、延長藥物作用時間的效果,這一研究為研發新的體外透皮制劑奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器AR124CN型電子分析天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司];XMTB型數顯恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海力辰邦西儀器科技有限公司);KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ZNCL-BS型智能磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);UV-2450型紫外分光光度儀(日本島津公司);TG16-WS型高速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司);EMS-8B型智能磁力攪拌器(天津市歐諾儀器儀表有限公司);PHSJ-4A型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司);RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);移液槍(德國艾本德公司);ZS90型納米粒徑電位分析儀(英國馬爾文公司)。

1.1.2 藥品與試劑無水乙醇(天津市匯杭化工科技有限公司,批號:20230220);阿侖膦酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);碳酸氫鈉(天津市瑞金特化學品有限公司);氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20230105);磷脂酰膽堿(上海畢得醫藥科技股份有限公司);膽固醇(上海行知化工廠);苯駢戊三酮(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20210208);氯化鉀(天津市北聯精細化學品開發有限公司,批號:20181120);無水磷酸氫二鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20221220);磷酸二氫鉀 (天津市鼎盛鑫化工有限公司,批號:20180307);鹽酸(萊陽經濟開發區精細化工廠,批號:20140607);氫氧化鈉(煙臺遠東精細化工有限公司,批號:20181018)。

1.2 方法

1.2.1 阿侖膦酸鈉的檢測稱取恒重的ALN 20 mg放入燒杯中并加入適量的純化水,在50 ℃水浴鍋中攪拌使其充分溶解,引流至100 mL的標準容量瓶中,并稀釋至刻度,配制成200 μg·mL-1標準溶液。吸取200 μg·mL-1ALN溶液分別稀釋成75、67、58、42、35、25、17 μg·mL-1至10 mL試管中,再加入0.75 mL的0.25 mol·L-1碳酸氫鈉溶液和0.5 mL的1%水合茚三酮溶液,搖勻后,至92 ℃的集熱式恒溫加熱磁力攪拌器內油浴加熱30 min,在加熱過程中打開試管蓋子,加熱完畢后取出自然冷卻至室溫,再滴加純化水稀釋至刻度。用蒸餾水同法制備的空白溶液為空白,在568 nm波長處測定吸光度(A),最后根據所得數據繪制吸光度-濃度曲線。

1.2.2 空白脂質體的制備空白脂質體的單因素試驗:選擇兩個對空白脂質體粒徑影響較大的因素進行單因素試驗,即膜材比(磷脂酰膽堿∶膽固醇)、磁力攪拌轉速。

精密稱取定量的磷脂酰膽堿0.125 g、膽固醇0.05 g 混合放置于燒杯中,然后將混合物溶解在20 mL三氯甲烷中。將燒杯置于恒溫磁力攪拌器上,(600 r·min-11.5 h)常溫下攪拌至完全溶解,將溶液轉移至圓底燒瓶中,減壓蒸發40 ℃ 除去三氯甲烷,燒瓶內壁出現一層透明薄膜,燒瓶中加入PBS(pH=7,0.03 mol·L-1)50 mL使膜充分水化,水化溫度45 ℃。水化至溶液呈現均勻狀態即可。水化后燒瓶置于超聲波清洗器內超聲 6 min,生成乳白色半透明溶液。抽取5 mL的半透明溶液,所得半透明溶液分別過0.45 μm和0.22 μm的微孔濾過膜3次,即得空白脂質體。取5 mL純水稀釋2倍,平行3次測定其粒徑及PDI分布,取平均值。

1.2.3 膜材比的確定固定膽固醇(0.05 g)的用量,依次改變磷脂酰膽堿的用量(0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 g),(膜材比分別為2∶1,2.5∶1,3∶1,3.5∶1,4∶1)在其他條件均不變的情況下,同上述空白脂質體制備的步驟進行試驗,在平均粒徑允許的范圍內,分別平行測定3次所得脂質體的粒徑分布和PDI,取平均值,并判斷最佳膜材比。根據PDI值的大小,PDI值越小,分布越均勻,選擇PDI值最小的,確定最佳的膜材比。

標準的考核指標是對該類產品質量把控最為關鍵的地方。標準設置的指標越嚴格，產品質量越有保障。但是過高的指標對于產品生產來說會產生很多困難，甚至無法批量穩定生產達到指標的合格產品。根據實際生產水平，綜合考慮安全性，標準設置了適宜的指標用來對產品進行考核和監督。關于FZ/T 73044-2012《針織配飾品》和FZ/T 82006-2018《機織配飾品》這兩個標準的考核指標分別從外觀質量和內在質量進行對比和分析。

1.2.4 磁力攪拌轉速的選擇選取膜材比的確定步驟中,篩選出的最佳膜材比(膜材比為2.5∶1)的磷脂酰膽堿和膽固醇放置于燒杯中,在其他條件均不變的情況下,同上述空白脂質體制備的步驟進行實驗,依次改變磁力攪拌器的轉速(500、600、700、800 r·min-1),進行其余4組試驗,分別測定所得脂質體的粒徑和PDI分布,以確定最佳的轉速。

1.2.5 阿侖膦酸鈉脂質體的制備取上述步驟篩選出的最佳膜材比和磁力攪拌轉速的條件進行載藥脂質體的制備。載藥脂質體的單因素試驗,通過測其包封率來判斷最佳條件。選擇對包封率影響較大的3個因素分別進行試驗,即脂藥比、超聲時間、水化溫度。

精密稱取0.125 g磷脂酰膽堿、0.05 g膽固醇、0.0125 g ALN(C=125 μg·mL-1)混合放置于燒杯中,然后將混合物溶解在20 mL三氯甲烷中。將燒杯置于恒溫磁力攪拌器上,(700 r·min-11.5 h)常溫下攪拌至完全溶解,后續與空白脂質體制備一致。

1.2.6 脂藥比保證超聲時間、水化溫度、轉速、膜材比不變的情況下。分別制備脂藥比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的脂質體溶液,測定其包封率及載藥效率。精密稱取0.125 g磷脂酰膽堿、0.05 g膽固醇、ALN(0.025、0.012 5、0.008 3、0.006 25 g)運用紫外分光光度法測定不同條件下的包封率,從而通過比較得出最佳脂藥比。

包封率及載藥效率的測定 包封率是評價藥物包載能力的重要指標,該試驗采用離心法測定其包封率[14],分別取一組1 mL的脂質體將其置于離心管中,8 000 r·min-1離心30 min,取上清液,為游離藥物濃度C1,另取一組1 mL的脂質體加入2 mL異丙醇破乳,為總的藥物濃度C。包封率計算公式如下:

包封率(EE)=C-C1/C×100%

1.2.7 超聲時間取上述最佳藥脂比進行試驗,在其他條件不變的情況下,改變每組的超聲時間(3、6、9 min)。同樣運用紫外分光光度法測定不同條件下的包封率,通過比較從而得出最佳超聲時間。

1.2.8 水化溫度取上述最佳藥脂比、超聲時間進行試驗,在其他條件不變的情況下,改變每組的成膜溫度(35、45、55 ℃)。同樣運用紫外分光光度法測定不同條件下的包封率,通過比較從而得出最佳溫度。

1.3 體外透皮試驗

1.3.1 原料藥液的豬皮體外經皮滲透試驗豬皮的處理∶用解剖刀去毛,用刀和剪去掉皮下脂肪,用生理鹽水洗凈。取皮膚完整性良好的豬皮,切割成擴散室與接收室之間的圓形大小或六邊形。將處理干凈剩余的豬皮用保鮮膜包好,儲存于-20 ℃的冰箱中,備用。使用時從冰箱中取出,置生理鹽水中30 min自然解凍。

將預處理好的豬皮擦干,將其放于擴散室與接收室之間用夾子固定。將角質層面向供應池。取阿侖膦酸鈉原料藥液2 mL(C=125 μg·mL-1),至擴散室,在接收室加滿純水,記錄接受室的體積。將雙室立式透皮擴散池置于智能磁力攪拌器中。水浴溫度控制在(32±1)℃,并以轉速為400 r·min-1勻速攪拌,在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h吸取接受液5 mL,注意每吸取一個樣,應立即補足相同體積的純水[16]。將所取樣品液各加入0.75 mL的 0.25 mol·L-1碳酸氫鈉溶液和0.5 mL 的1 %水合茚三酮乙醇溶液于10 mL試管中,搖晃均勻,置92 ℃的集熱式恒溫加熱磁力攪拌器內油浴加熱30 min,取出試管使其自然冷卻到室溫,最后使用純水將其稀釋至刻度。同時取用純水,同上操作,作為空白溶液,在568 nm波長處測定所配溶液的吸光度(A)。同時取出在擴散室與接收室之間的豬皮,觀察其表面形態,載藥脂質體透皮過的豬皮表面(見圖1),光滑有潤澤,說明具有一定的潤濕性,對皮膚表面的刺激較小。

圖1 經ALN脂質體透過的豬皮(從左到右依次為平行試驗的1～3組)

累計滲透量的計算:按標準曲線方程計算各時間點的藥物濃度,按下式計算累積滲透量:

Q=(Cn×V+Ci×V0)/S (Q:μg·cm-2)

式中,Cn為第n點測得的藥物濃度(μg·mL-1),Ci為第i個點測得的藥物濃度(μg·mL-1),V接受室的總容積(mL),V0是每次取樣體積(mL),S是滲透體積(cm2)。計算累積滲透量,重復3次,記錄試驗結果。

1.3.2 載藥脂質體的體外透皮試驗選擇單因素試驗中篩選出的最佳條件制備的載藥脂質體,依據上述實驗方法把原料藥液換成載藥脂質體,其他方法同上重復3次透皮試驗,記錄試驗結果。

1.3.3 體外釋放模型的擬合Origin 2018 64Bit軟件產于美國Origin Lab公司,該軟件可對藥物釋放度進行曲線擬合,來掌握藥物釋放的規律。為了考察脂質體的釋藥模型和緩釋性能,將累積滲透量分別進行零級釋放動力學,一級釋放動力學,Higuchi釋放模型,Rigter-Peppas釋放模型的擬合。看其R2值的大小,R2值最接近1即最符合哪個模型。

2 結果

2.1 阿侖膦酸鈉檢測文獻調查顯示,ALN本身沒有發色團[17],但在堿性條件下可與茚三酮反應生成紫色絡合物(見圖2)。可用于測定ALN含量的方法很少,紫外分光光度技術具有操作簡單和靈敏度較高的顯著優勢[18]。通過配置不同濃度的阿侖膦酸鈉標準溶液,選取稀釋后的7個濃度(75、67、58、42、35、25、17 μg·mL-1)測定其吸光度,并進行線性擬合,最終得到擬合方程為Y=-0.314 18+0.021 57X,R2=0.999 0,表明溶液在17～75 μg之間呈現良好的線性關系。

圖2 阿侖膦酸鈉與水合茚三酮的反應方程式

2.2 空白脂質體

2.2.1 膜材比和轉速制備出空白脂質體的照片,溶液呈乳白色,無雜質沉淀,均一穩定(見圖3A)。不同膜材比的平均粒徑和PDI值,PDI指多分散系數,代表均勻分散的程度。研究表明,如果分散系數越小,說明粒子分布越均勻,粒子大小分布越集中,可以看出在磷脂和膽固醇比例分別為2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1時,其他條件不變的情況下,脂質體的平均粒徑(見圖3B)分別是231.7、255.8、238.1、228.1、222.3 nm。研究表明脂質體的粒徑應在100～1 000 nm之間,當平均粒徑均在允許的范圍內,通過進一步比較不同條件下PDI的大小,發現磷脂酰膽堿與膽固醇的比例為2.5∶1時PDI最小,因此,本研究制備脂質體時選擇的膜材比為2.5∶1。在不同攪拌轉速下的粒徑及PDI分布(見圖3C)中,當攪拌轉速分別為400、500、600、700、800 r·min-1時,在膜材比和超聲時間、水化溫度等不變的情況下,其平均粒徑分別是222.8、215.4、292.9、252.0、256.2 nm。可知在平均粒徑允許的范圍內,再比較不同條件下的PDI的大小,轉速為700 r·min-1時PDI最小,因此,制備脂質體應選擇的攪拌轉速為700 r·min-1。

圖3 空白脂質體(A)、不同膜材比下的粒徑和PDI(B)、不同轉速下的粒徑和PDI(C)

2.3 載藥脂質體

2.3.1 脂藥比分別在5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的條件下,保持攪拌轉速、超聲時間、水化溫度不變,經納米粒徑電位分析儀測3次得到其包封的平均粒徑(見表1)。隨著脂藥比的增大,包封率呈現先增大后降低的趨勢,這表明當ALN用量較低時,并不能被有效地包裹在脂質體內,部分ALN在脂質體空隙間游離。隨著投藥量的增加,脂質體的包封率也增加,但ALN的大量增加,使得脂質體囊泡難以包埋所有的ALN,導致過量藥物游離,包封率下降。因此會出現包封率先上升在下降的趨勢。脂藥比在10∶1的時候包封率最高,故選擇脂藥比為10∶1為最佳脂藥比。

表1 不同脂藥比的包封率

2.3.2 超聲時間隨著超聲時間的延長,脂質體的粒徑越來越小,脂質體的粒徑減小,包封率也隨之下降,這是由于適當的超聲時間可使得體系中較大脂質體囊泡分裂成較小的、均一的囊泡,從而起到乳化穩定的作用。當超聲時間過長時,脂質體系統的溫度會升高,脂質體的囊泡結構會有一定程度的損壞。可知超聲3 min與超聲6 min包封率相差很小,超聲時間在小于6 min之內對包封率的影響較小,但3 min超聲時間過短,溶液的PDI較大(見表2),溶液不穩定,綜合考慮[19]超聲時間6 min為最佳超聲時間。超聲方式的選擇∶經超聲后再分散的脂質體,更加均一穩定[20]。本研究采用水浴超聲,水浴超聲為制備多囊泡脂質體的主要方式,對脂質體的結構破壞性較小,經水浴超聲后可獲得均一穩定的脂質體;而探針超聲對脂質體的結構破壞性較大,為小單室脂質體的主要超聲方式。

表2 不同超聲時間下的粒徑、PDI和包封率

2.3.3 水化溫度隨著水化溫度的升高,包封率先升高后降低(表3),水化溫度過低不利于脂質膜吸水溶脹,影響藥物的包裹效率;水化溫度過高時脂質體內的囊泡結構可能會遭到破壞,磷脂材料也會發生氧化變質,進而導致包封率下降。說明熱穩定性變化對于脂質體的穩定性[21]有著顯著影響。水化溫度在45 ℃時包封率達到最大,因此選擇45 ℃為最佳水化溫度。

表3 不同水化溫度下的粒徑、PDI和包封率

2.4 體外透皮試驗脂質體是改善親水性,難溶性和大分子藥物透皮遞送的有利載體[22];是協同促滲的關鍵因素,其常與物理促滲、藥劑學促滲方法相結合來遞送大分子藥物。脂質體不但可以包裹親脂、親水、兩親性藥物,還憑借著與皮膚細胞膜相似的雙分子層結構,可增加在角質層(SC)內的蓄積量,從而達到緩慢釋藥的效果[23]。從體內外釋放角度來看,是各個囊泡逐漸破裂,藥物逐步釋放,因此具有長效緩釋的作用[24]。被脂質體包封的藥物可以免受其他藥物進入人體內發生的生理反應,避免藥物被酶降解,從而改善和延長藥物在體內循環的時間[25]。

經過24 h的體外經皮滲透試驗(見圖4a),隨著時間的延長,原液和脂質體的累積滲透量均不斷增加,且平行幾組滲透量之間的誤差較小。在透皮給藥的前8 h內,原液和ALN脂質體的累積透過量大小基本一致,與原液相比ALN脂質體的釋藥沒有明顯的突釋,說明脂質體對于藥物存在滯留作用,藥物被包封在磷脂膜中從而達到緩慢釋藥的效果。在8 h之后,脂質體中包裹藥物的囊泡開始逐個破裂,ALN脂質體的累積滲透量逐漸超過原液的累積滲透量,并且累積滲透量最大可達814.78 μg·mL-1,相當于原液透過量的兩倍,也詮釋了ALN脂質體具有長效、緩釋的作用。

圖4 原料藥和脂質體的累積滲透量(a)與滲透速率(b)

在滲透速率中(見圖4b),在0～0.5 h之間原料藥的滲透速率較大,由于藥物被脂質體包封,使得脂質體滲透速率較小。在1～4 h之間兩者滲透速率相差不大,在6 h之后大量脂質體囊泡破裂,在角質層內形成聚集,進而透過豬皮快速釋放藥物,使得滲透速率開始超過原料藥液,滲透速率逐步增大。又因為脂質體屬于膠體系統,具有水合作用和融合釋藥兩個特點,脂質體提供的外源性雙層膜,使得角質層細胞間的結構改變,進而使得藥物通過擴散和毛細管作用進入細胞間隙。脂質體中的磷脂與角質層脂質融合以后,被細胞內溶酶體所破壞,從而實現藥物的緩慢持久釋放[26],最后趨于穩定。且原料藥與脂質體的幾組平行試驗的誤差較小,重復性較好。

2.5 釋放模型Higuchi方程(釋放機制為Fick擴散)和零級動力學方程(釋放機制為恒速釋放)是評估脂質體釋放行為的主要方程。Ritger-Peppas模型中的釋放參數n<0.45時,服從Fick擴散機制;n>0.89時,為骨架溶蝕機制;0.45

兩者透皮基本符合零級、一級動力學方程(R2>0.90)(見表4),說明皮膚對藥物的透皮存在限制,且有一定的緩釋作用[27]。其中原料藥透透皮中Ritger-Peppas方程的擬合最佳(R2>0.997),參數n=0.52為擴散和溶蝕型釋放。脂質體透皮中的零級動力學方程擬合最佳,(R2>0.98),說明釋放機制為恒速釋放[28],符合脂質體作為緩控釋藥物的釋藥原理,具有緩慢持久釋放藥物的作用。

表4 原料藥和脂質體平均擬合方程的R2值

3 討論

本試驗制備了含ALN的脂質體并探究了其透皮性能,用紫外分光光度法測得的ALN溶液的標準曲線,方程線性系數在0.999以上,ALN溶液在17～75 μg·mL-1范圍內線性良好。篩選出制備脂質體的最佳條件為膜材比2.5∶1、轉速700 r·min-1、脂藥比10∶1、超聲時間6 min、水化溫度45 ℃、包封率和載藥效率最大分別為49.6%和14%。透皮實驗中,脂質體的累積滲透量最大為814.78 μg·cm-2相當于原料藥液的兩倍。在滲透速率比較中,脂質體的釋藥速度表現為緩慢且持久的釋放,表現出脂質體緩釋的特性。動力學釋放模型也證實了脂質體在釋藥過程可形成多儲庫型系統,從而增強了緩釋和控釋效果。

本試驗制備了含ALN的脂質體,也對未來脂質體的綜合性能提高提出挑戰,具有進一步臨床應用的潛力。與原液相比,采用脂質體作為藥物傳遞載體后,藥物的累積滲透量升高,也表明含ALN脂質體比ALN原液更容易穿透皮膚。綜上所述,采用脂質體作為載體增加了皮膚中ALN的含量,從而延遲了ALN的釋放。研究證明了脂質體包封的ALN的可行性,從而為研究透皮效果好、透過效率強的外用新劑型提供了參考,同時也證實了ALN脂質體可以顯著提高透皮吸收速率,增加皮膚蓄積量。但脂質體仍存在物理穩定性差,包封率低等缺點,因此如何進一步增強物理穩定性,提高藥物在皮膚內的滯留時間以達到最佳的緩釋效果,是一直需要探討的問題。

為方便用藥,可在脂質體的形態上做進一步改進,增加ALN脂質體溶液的黏度做成便于涂布的膠狀,增加藥物在皮膚表面的停留時間,如將脂質體包封于水凝膠中或做成傷口輔料貼劑等多種制劑來逐步增加藥物在皮膚內的滯留量,延長藥物作用時間,提高藥物利用率。從脂質體類型出發進一步改進,在脂質體的組成部分中可加入表面活性劑等溶劑,使脂質體的柔性增加,增強脂質體的滲透能力。