熔融沉積3D打印技術制備對乙酰氨基酚緩釋片及其制劑學評價

陳銘,王琛,張志強,段美濤,任君剛,林海婷

(廈門醫學院,福建 廈門 361000)

3D打印成型技術(3D printing technology),又稱增材制造技術(additive manufacturing technology),是一種通過特定的成型設備,將粉末、液體或者絲狀輔料,通過逐層打印的方式來構造重現數字模型文件的技術。3D打印憑借其獨特的個性化、設計性優勢,逐漸被應用于藥物制劑領域[1]。目前,藥物制劑生產過程中所運用到的3D打印技術主要包括熔融沉積法、物料噴射法、粉末床熔融法、光聚合法等[2],其中熔融沉積成型技術(fused deposition modeling,FDM)是擠出成型技術中應用較廣泛的技術之一[3]。FDM是一種利用熱塑性長絲為起始材料,并將其通過熔融擠出,進行層層黏結、創建3D對象的技術[4]。FDM 3D打印過程的一般包括建模、載藥長絲的取得及目標制劑的打印幾個步驟[5]。其中熱熔擠出(hot melt extrusion,HME)技術常與FDM 3D打印技術聯合,通過將藥物與輔料投入擠出機中熔融混合,生產出質量優良的高質量中間體細絲以供后續制備。常用于細絲制備的一些常見聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)和聚乳酸等[6],這些聚合物常常具有較好的生物可降解性、較低的毒性和良好的熔融加工性。通過將活性藥物成分結合在這些聚合物基質中,可使得藥物穩定性增加,分布更加均勻。同時,通過合理的輔料設計(如添加適宜的增塑劑)可增加細絲的光滑度、平整性與機械強度,從而利于后續片劑的制備[7]。相較于傳統片劑的煩瑣壓片工藝,FDM 3D打印技術不需要將藥物與輔料預混合、制粒、干燥、壓片,而只需要制備出適合3D打印機進料口直徑的線材,便可以通過在打印平面上層層疊加成片劑形狀[8]。其簡單便捷、省時高效的操作工序,可大大節省制劑制備時間。

對乙酰氨基酚是臨床上常用的非甾體抗炎藥,常被用于退熱、緩解疼痛。對乙酰氨基酚微溶于水[9],其吸收由溶出速率決定,常導致生物利用度下降。目前,對乙酰氨基酚上市的劑型包括片劑、注射劑、栓劑、膠囊劑、顆粒劑、滴劑、凝膠劑等,其中片劑類型包括普通片、緩釋片、控釋片、咀嚼片和泡騰片等[10-12]。例如,國家藥監局通過快速審批通道,批準了對乙酰氨基酚維生素C泡騰片等新冠病毒感染對癥治療藥物上市,取得顯著成效。然而對乙酰氨基酚常易產生較強的肝腎毒性,市售對乙酰氨基酚片仍存在劑量控制、突釋毒性等方面的問題[13],導致治療效果不佳或產生潛在肝腎功能損傷。目前,研究者正在致力于研發更多對乙酰氨基酚新劑型,以提高生物利用率,提高治療效率。如用結合個性化3D打印技術進行制備。例如,劉伯石等[14-15]運用熱熔擠出3D打印技術以soluplus為熱熔基質、PEG6000作為增塑劑成功制備對乙酰氨基酚片,證實了對乙酰氨基酚新劑型研發可行性及潛力性。

本文旨在使用熔融沉積成型技術制備對乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)片,通過過程優化設計,實現過程簡單,劑量可控的對乙酰氨基酚緩釋片劑制備,充分發揮3D打印技術在制備片劑中的獨特優勢,使對乙酰氨基酚在片劑中緩慢釋放,為對乙酰氨基酚片劑提供簡捷可控的新制備方法,為3D打印技術臨床應用提供前期試驗依據及理論可行性探索。

1 儀器與試劑

1.1 儀器Minin CTW熱熔擠出機(德國Thermo公司);BCN 3D 3D打印機(美國Sigma公司);Elite8藥物溶出度儀(美國Hanson公司);UV-1800紫外-分光光度計(日本島津公司);UVmini-1240紫外-分光光度計(日本島津公司);MNT-150游標卡尺(德國美耐特公司);AR124CN天平(美國奧豪斯公司);FlexSEM1000掃描電鏡(日本日立公司);DSC 200 F3熱重分析儀(德國耐馳公司)。

1.2 試劑對乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:G2017182);乙基纖維素(ethyl cellulose,EC,上海阿拉丁,批號:E110667);羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methylcellulose,HPMC,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:L1904117);聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(kollidon VA64,上海麥克林生化科技股份有限公司,批號:C10726892);檸檬酸三乙酯(triethyl citrate,TEC,上海麥克林生化科技股份有限公司,批號:C12021119);鹽酸(hydrochloric acid,HCl,西隴科學股份有限公司,批號:2004181);共聚維酮 S-630(polyplasdone S-630,上海森君化工制劑輔料有限公司,批號:0002268269);丙烯酸樹脂[Eudragit RS100,贏創特種化學(上海)有限公司,批號:B180808811];聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物(kollicoat IR,北京鳳禮精求醫藥股份有限公司,批號:91613924U0)。

2 試驗方法

2.1 制備工藝流程將對乙酰氨基酚與輔料以一定的比例混合均勻,在雙螺桿熱熔擠出機上以一定的溫度通過擠出口擠出,通過改變?？字睆街苽溥m合3D打印機進料口的線材。進行計算機模型建立(123 Design Software),構建大小為14 mm×20 mm×4 mm的藥片。同時對該藥片進行模型切片(BCN 3D Cure),調整參數至3D打印設備所能識別的信號(gode格式文件),將上述制備的線材通過進料口直徑為2.85 mm的打印機,在一定的溫度下熔融,經直徑為0.4 mm的噴嘴在平臺上逐層疊加成目標產品。

2.2 含量測定

2.2.1 專屬性考察精密稱取約對乙酰氨基酚40 mg,于250 mL容量瓶中定容,稀釋20倍,得濃度8 μg·mL-1的對乙酰氨基酚溶液,同法制備不含對乙酰氨基酚的陰性對照溶液。用紫外分光光度計對上述溶液進行吸收波長掃描,確定最大吸收波長。紫外分光光度測定按照《中國藥典》2020年版,照紫外-可見分光光度法(通則0401)測定。

2.2.2 線性關系與范圍考察精密稱取對乙酰氨基酚,并按上述方法配制成濃度為4、5、6、7、8、9、10 μg·mL-1的對乙酰氨基酚溶液,在最大吸收波長處測定吸光度(A),繪制回歸曲線。

2.3 熱重分析利用熱重分析技術對主藥進行分析。參數設定為:升溫速率10 K·min-1,升溫范圍25～600 ℃,氬氣流速5 mL·min-1[14]。

2.4 處方工藝篩選

2.4.1 輔料的初步選擇將對乙酰氨基酚以及載體輔料:乙基纖維素(EC-N14)、聚乙烯吡咯烷酮—乙酸乙烯酯共聚物(kollidon VA64)、丙烯酸樹脂(eudragit RS100)、聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物(kollicoat IR)、共聚維酮 S-630(COP S-630),進行材料的單獨擠出試驗,初步探索各種輔料的擠出溫度及擠出性能,通過比較不同載體輔料擠出的線材質量,對輔料進行初步篩選。將對乙酰氨基酚與各輔料以比例為23∶77混合后擠出[10],通過觀察對比,比較不同處方擠出物的黏度、光滑度、韌性、均勻性、直徑等進行進一步的篩選。

2.4.2 處方單因素考察

2.4.2.1 增塑劑考察對增塑劑檸檬酸三乙酯(TEC)、三乙酸甘油酯(GTA)、聚乙二醇(PEG)6000進行篩選,并用篩選后的優化增塑劑進行用量篩選,以相當于處方EC量的5%、10%、15%、20%、25%,考察選用的增塑劑的用量對擠出溫度及擠出物的影響。在預試驗過程中,發現檸檬酸三乙酯(TEC)作為EC的增塑劑能較好地改善擠出物的脆性,增加韌性,利于片劑的順利打印。

2.4.2.2 致孔劑種類考察在體外預試驗過程中發現由上述輔料制備的對乙酰氨基酚片24 h累計釋放度不足10%,因此對致孔劑羥丙基甲基纖維素(HPMC)、微晶纖維素(MCC)、氯化鈉(NaCl)進行篩選。

2.4.2.3 對乙酰氨基酚含量對打印結果影響考察固定EC與HPMC的比例為3∶1,設置對乙酰氨基酚的含量為20%、25%、30%,與輔料混合均勻后進行擠出后打印成片劑,觀察片劑的完整性。

2.4.2.4 塑化EC與HPMC的比例塑化EC與HPMC的比例對擠出溫度及體外釋放的影響考察:固定對乙酰氨基酚的含量為25%,設置不同EC與HPMC的比例進行擠出制備線材。制備的片劑照體外釋放項下的方法進行溶出度測定。

2.4.3 工藝參數單因素考察

2.4.3.1 擠出溫度、轉速影響考察按處方以等量遞加的方法混合粉末,設置擠出溫度為130、135、140 ℃,通過擠出?？诪? mm的?？跀D出,用游標卡尺測量擠出線材的直徑。擠出轉速對擠出線材直徑的影響考察:按處方量將粉末混合均勻,擠出轉速設定為10、30、60 r·min-1,擠出的模孔直徑為2 mm,擠出的線材直徑用游標卡尺測量。

2.4.3.2 打印溫度對片劑外觀和累計釋放度的影響考察按處方量將各物料混合均勻,經熱熔擠出機擠出成線材后,在不同的溫度下打印,照體外釋放項方法進行溶出度的測定。

2.4.4 正交試驗通過上述處方及工藝參數單因素考察,發現塑化EC與HPMC的比例、打印溫度是影響藥物溶出度及片劑外觀的重要因素。為了考察2種因素之間的相互作用,進一步優化處方,對其進行兩因素三水平的試驗設計,以藥物在2 (Q2)及12 h(Q12)時的累積釋放百分率、片劑外觀為評價指標,進行綜合評分(滿分為100分),其中Q2占50%,Q12占30%,片劑外觀占20%,外觀評價包括片劑完整性和層間疊加平整性。正交試驗設計(因素、水平)見表1。

表1 正交設計試驗的因素及水平

2.5 體外釋放度考察對乙酰氨基酚片的體外釋放度考察照《中國藥典》 2020年版釋放度測定法規定進行(通則0931第一法)測定。取900 mL溶出介質,在時間點為30 min、2、4、8、12、24 h時采集樣品10 mL,同時補充同溫介質10 mL,累積釋放百分率Q用如下公式計算[16]:

其中,V0表示溶出試驗選擇介質的總體積(mL),Ct表示取樣各時間點的藥物濃度(μg·mL-1),Vi表示各時間點取樣的體積(mL),Ci表示各時間點的藥物濃度,W表示對乙酰氨基酚片的重量(mg),F表示對乙酰氨基酚在制劑中的含藥量(%)。

2.6 掃描電鏡取對乙酰氨基酚片,將其放置在導電黏合劑上,真空噴金15 s后,在超高分辨率場發射掃描電子顯微鏡下進行觀察,捕獲線材的表面和橫截面,考察片劑的表面結構。

2.7 差示掃描量熱法將對乙酰氨基酚原料粉末、輔料混合粉末、對乙酰氨基酚與輔料混合粉末與對乙酰氨基酚片研磨粉4組置于鋁坩堝中,用差示掃描量熱儀以10 K·min-1升溫速率掃描,升溫范圍0～300 ℃,得DSC圖譜,觀察不同組粉末隨溫度變化的供熱速率差曲線,分析對乙酰氨基酚的晶型結構變化。

3 結果與討論

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性考察紫外光譜圖顯示在257 nm波長處,對乙酰氨基酚對照品和供試品有最大吸收峰,而空白輔料在此波長下無明顯的吸收峰,說明輔料在257 nm附近對主藥的吸收峰無干擾。故選擇測定的最大吸收波長為257 nm。

3.1.2 線性評價考察通過紫外分光光度計測量后,以吸光度為縱坐標(Y),以對乙酰氨基酚濃度為橫坐標(X)進行線性回歸,即得257 nm波長處不同濃度對乙酰氨基酚溶液的吸光度(A)與其濃度(μg·mL-1)的回歸方程。曲線方程為:Y= 0.071 6X+0.001 2,R2=0.999 8,結果表明在濃度范圍4～10 μg·mL-1范圍內,有良好的線性關系。

3.2 熱重分析結果對乙酰氨基酚熱重分析結果如圖1所示。可見對乙酰氨基酚在205 ℃時開始降解,378 ℃時降解完全,片劑打印在試驗溫度為160～170 ℃時含量穩定。

圖1 對乙酰氨基酚熱重分析結果

3.3 處方工藝篩選結果

3.3.1 輔料的初步選擇由表2可知,對乙酰氨基酚與不同輔料混合后擠出的線材之間差異較大,其中kollidon VA64、Eudragit RS100擠出線材的內部有氣泡,經打印機噴嘴擠出的細絲也有氣泡,打印出的片劑外觀粗糙;COP S-630擠出線材的直徑粗細不均,并且其間隔范圍較大;Kollicoat IR擠出線材的韌性較差,并且其與API擠出的線材均勻性較差。而以EC為輔料擠出的線材較光滑、均勻性較好。經過對輔料擠出結果的綜合評價,最終選擇作為對乙酰氨基酚的載體基質為EC,其直徑粗細較均勻,并且略小于打印機進料口直徑的2.85 mm。

表2 不同輔料、擠出溫度所得含藥/空白線材的外觀表征

3.3.2 工藝參數單因素考察經篩選后擠出的線材較脆,打印有中斷現象,無法打印出完整的片劑,考慮進一步加入增塑劑如檸檬酸三乙酯改變其流變學特性改善此現象。增塑劑種類及用量考察結果如表3所示,選用優選后的增塑劑TEC,后進一步考察其用量對擠出溫度及擠出線材的影響。結果表明加入增塑劑的處方擠出溫度較未加入增塑劑處方高,增塑劑的用量為5%、10%的處方在擠出溫度為170 ℃時能較好地擠出;增塑劑用量為15%、20%的處方在165 ℃時就能順利擠出,并且用量為20%時的線材韌性較用量為5%、10%、15%的擠出效果好;而用量為25%的處方制備出的線材較軟,在打印機的進料口處流動性較差,導致打印不順暢,故優先選用的TEC的用量為處方量EC的20%。

表3 加入不同種類增塑劑后線材質量表征

篩選試驗中同樣考察了致孔劑種類對最終藥物釋放度的影響。結果表明當HPMC作為致孔劑,增加溶出度的效果最好,其24 h平均累積釋藥度95%以上,效果優于NaCl(69.11%)與MCC(43.09%)。在加入致孔劑后,進一步對主藥含量、比例等因素進行了篩選,結果表明主藥含量為20%、25%的線材在打印過程中較流暢,并且片劑外觀較好;主藥含量為30%的線材,易堵住打印機的噴嘴,無法打印片劑。故選擇主藥含量為25%的線材。同時,塑化EC:HPMC的比例對片劑外觀的影響較輕,對體外釋放結果影響比較顯著。

3.3.3 工藝參數單因素評價經篩選,處方在130 ℃時無法順利擠出;135 ℃時擠出的線材韌性適中,擠出的線材均勻性均較好,直徑為2.60 mm;140 ℃時擠出的線材由于擠出時溫度較高,可塑性較強,由于重力的作用,線材被拉長,其直徑變細甚至斷成兩截。因此優先選用的擠出溫度為135 ℃。

通過改變擠出轉速發現擠出轉速應設定在10～60 r·min-1之間。在此轉速下,擠出線材的直徑大于2 mm(2.58～2.62 mm),小于進料口直徑(2.85 mm),能順利地打印片劑。而當打印溫度較高時,線材熔融堆積導致打印機噴嘴吐絲量過多,層間疊加不平整;打印溫度較低時,由于線材熔融的時間延長,導致打印機在運行過程中吐絲不均勻,片劑成型性較差。

3.3.4 正交試驗結果經表1確定正交設計試驗的因素及水平,并經由表3確定正交設計評分標準。通過外觀、體外2 h釋放率及體外12 h釋放率評價處方得分,正交設計試驗方案及結果見表4～5。由正交試驗結果可知,塑化EC與HPMC的比例是影響藥物體外釋放的主要因素,打印溫度主要影響片劑的外觀,經正交試驗優化后的塑化EC與HPMC的最佳比例為50∶25,最佳打印溫度為160 ℃。

表4 正交設計評分標準表

表5 正交設計試驗方案及結果

3.4 成片含量測定與體外釋放結果考察按前述方法檢測對乙酰氨基酚片中的含量及其體外釋放規律。含量測定結果顯示使用FDM技術制備的對乙酰氨基酚片的含量為96.92%,RSD為0.1%,符合藥典規定。體外釋放結果表明所制備的對乙酰氨基酚片釋放時間約為24 h,較多數上市對乙酰氨基酚片劑而言可實現緩慢釋放[17],其6 h釋放率約50%,且藥物累積釋放可達95%以上。

3.5 對乙酰氨基酚片釋放前后掃描電鏡結果考察對乙酰氨基酚粉末及對乙酰氨基酚片掃描電鏡結果如圖2～3所示。圖3描述了3D打印對乙酰體外釋放前后外觀及顯微狀態圖。由圖2(a)可知,對乙酰氨基酚片在釋放前形狀均勻,外觀完整,表面結合緊密,成橢圓形片狀。同時,其顯微鏡下電鏡圖可見片劑內部藥物與輔料之間結合致密[見圖2(b)],不存在明顯空隙。由圖2(c)的片劑側面顯微鏡下圖可見片劑釋放藥物前,FDM 3D打印效果良好,層間緊密堆積,層層疊加且層間疊加平整。將對乙酰氨基酚片于適當溶劑中釋放24 h后,片劑總體外觀較先前變化不大[見圖2(a)],其微觀表面較釋放前相比出現輕微溶蝕現象[見圖2(e)],紅色箭頭處),但表面結合仍然緊密。片劑層間疊加依然穩固,藥片釋放前后的總體骨架變化不大,但側視顯微圖中可見層內出現輕微空隙[見圖2(f)],紅色箭頭處),考慮可能是釋放過程中的水分滲入作用導致。由圖2可推斷,藥物可能在水不溶性骨架材料乙基纖維素中以骨架溶蝕的方式緩慢釋放。

a.體外釋放前片劑外觀圖;b.體外釋放前片劑表面圖;c.體外釋放前片劑側視圖;d.體外釋放24 h后外觀圖;e.體外釋放24 h后片劑表面圖;f.體外釋放24 h后片劑側視圖圖2 體外釋放前后對乙酰氨基酚片劑外觀、顯微狀態圖

a.對乙酰氨基酚制品顯微狀態圖,左為對乙酰氨基酚粉末,右為對乙酰氨基酚片;b.對乙酰氨基酚原料藥、輔料、原輔料混合、及片劑粉末差示量熱掃描圖圖3 對乙酰氨基酚制品顯微狀態及差示量熱掃描圖

3.6 對乙酰氨基酚在制備過程晶型變化考察對乙酰氨基酚在制備過程中的晶形變化考察結果如圖3所示。由圖3(a)可知,顯微鏡下對乙酰氨基酚粉末(左)及對乙酰氨基酚片劑中(右)均出現立方體型晶體狀物質,由此推測對乙酰氨基酚粉末以結晶形式單獨存在,并且在片劑中可能仍然以結晶形式分布于輔料中,且表現為立方體晶形狀。進一步由DSC圖譜可推斷[見圖3(b)],純對乙酰氨基酚原料藥在未加熱時晶型為form I(單斜型,熔融溫度為168～172 ℃)。對乙酰氨基酚原料藥與輔料混合時,對乙酰氨基酚晶型部分轉變為form Ⅱ(正交型),范圍變寬,推測部分晶型的轉變與大分子輔料中羧基、羧酸的參與相關[18]。而在經過FDM 3D打印的對乙酰氨基酚片劑中,經過對乙酰氨基酚原料藥與輔料混合加熱,對乙酰氨基酚晶體存在形式全部轉變為form Ⅱ(正交型,熔融溫度為154～160 ℃)。該轉變符合文獻中溫度升高時對乙酰氨基酚的晶型轉換規律[19]。

4 討論與結論

FDM技術在制劑生產的3D打印中應用最為廣泛,目前已可用于各種片劑及緩、控釋制劑的制備。本試驗中,以對乙酰氨基酚為主藥,以聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸(PLA)、羥丙基纖維素(HPC)、纖維素衍生物等熱塑性聚合物為輔料,通過熱熔擠出技術擠出長絲,并檢驗了打印過程的流暢性(進料是否順暢)、黏彈性(擠出是否順暢)與室溫成型性等。熱熔擠出步驟不僅影響著制劑的可打印性,也影響打印片劑的硬度、崩解、溶出等關鍵性能。通過篩選,確定了最優處方組成為APAP∶塑化EC∶HPMC=25∶50∶25,TEC用量為20% EC。篩選出最優長絲輔料后,本試驗進一步對擠出與打印參數(如擠出溫度、擠出速度、打印溫度等)進行篩選,以實現最佳的片劑機械性質及釋藥特性。通過考察,最終確定擠出轉速為30 r·min-1,擠出溫度為135 ℃。此外,打印溫度主要影響片劑的表觀及體外釋放結果,FDM技術的打印溫度范圍通常介于150～230 ℃之間。通過試驗發現,打印溫度160～170 ℃時,制備的片劑外觀完整、層間疊加平整,對乙酰氨基酚在試驗溫度下穩定,含量測定合格,24 h體外釋放累積百分率90%以上,預測藥物以骨架溶蝕的方式緩慢釋放。

在藥劑學領域,活性藥物成分的生物利用度的提高是當前藥物開發中面臨的最大挑戰之一,而影響生物利用度的最常見問題則是水溶性問題。以對乙酰氨基酚為例,其高結晶度凝聚可能會降低其溶解度,從而影響其生物利用率。基于此,使用更多的可溶性固體形式,如多晶或無定形系統,可以增加溶解度,提高生物利用度[20-21]。而FDM 3D打印技術即是最常見的實現多晶共存、無定型系統的形成的工藝之一。同時,FDM 3D打印常可通過固化熔體的致密性減慢藥物的釋放,從而相應地減緩藥物在體內的代謝與排泄。這種熔融效應同樣也可解決壓片過程中乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等高分子輔料出現的可壓性差、密度差異大、難以混勻等問題。在適宜的溫度下(160 ℃)及增塑劑檸檬酸三乙酯的參與下,高分子輔料被制備為機械強度更高的片劑,其硬度增加、脆碎度減小,層間結合更加緊密,成形性增加[7]。

FDM 3D打印技術可實現對3D建模的最大化還原。本試驗中,質量優良的載藥細絲為3D建模的重現提供了基礎,在此基礎上對乙酰氨基酚緩釋片劑的成功制備也為3D打印藥品的個性化定制提供了可行性證明。通過簡單改變3D模型的尺寸,即可影響最終成片的尺寸與劑量,為幼兒、老人等特殊人群實現定制服藥[22]。同時,若在設計過程中換用低密度輔料,改變載藥細絲的密度,則可使得片劑在胃中漂浮,從而增加其胃滯留時間[23]。然而,目前關于FDM 3D打印的相關設計仍然限于熱塑材料的打印。如何進一步的優化FDM 3D技術過程的局限性,降低打印過程中材料的黏度,發揮更多輔料運用于藥劑學領域的作用,仍需要進一步研究與改進。同時,由于過程的難以量產性,如何對3D打印技術進行監管、技術更新等一系列的問題仍值得探討。如何更充分地利用3D打印技術的優勢,發揮其個性化制劑研發特征,增強多學科融合,是未來仍需考慮與優化的方向。相信隨著技術的不斷成熟,3D打印技術在制劑行業的應用會更加廣泛。