仙茅鹽蒸炮制工藝優選

張一美,王巍,李利華,朱琳,鞠成國,2

(1．遼寧中醫藥大學藥學院,遼寧 大連 116600;2.國家中醫藥管理局中藥炮制技術傳承基地<遼寧>,遼寧 大連 116600)

仙茅為石蒜科植物仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)的干燥根莖,具有補腎陽、強筋骨、去寒濕的功效[1]。仙茅始載于《雷公炮炙論》,常用于腎陽不足、陽痿精冷、筋骨痿軟、腰膝冷痛、寒虛崩漏、帶下、癆虛內傷等臨床病癥[2]。仙茅的化學成分主要包括酚類、桉烷類、黃酮類、多糖類、木脂素類、生物堿類、揮發油等[3]?，F代藥理研究表明仙茅具有免疫調節、抗氧化、抗骨質疏松[4]、抗關節炎、抗腫瘤、保肝[5]、抗炎[6]、血管保護[7]等作用,臨床上多用于治療類風濕性關節炎、慢性腎炎、骨質疏松癥、腎陽不足所致的陽痿早泄及更年期綜合征等疾病[8]。

歷代仙茅炮制方法主要有藥汁制、泔水制、酒炒、酒浸、酒蒸等[9]。與古代炮制方法相比,現代炮制方法以酒炙法為主,而對鹽制法記載較少?！顿F州省中藥飲片炮制規范》(1986年版、2005年版)中新增了“用淡鹽水漂約1 h,瀝干,蒸至上氣”的記載[10-11],采用食鹽水來對仙茅進行炮制,以更好地發揮仙茅補腎陽、祛風濕、強筋骨的功效。鹽制中藥始載于《雷公炮炙論》,根據辨證論治的需要,用鹽制法炮制中藥,取其引經、咸味、寒性、功用等作用,以改變或緩和藥性,從而達到提高臨床療效的目的。而仙茅歸腎經[1],中藥炮制又有“入鹽走腎臟”的傳統理論,同時在中藥理論中,五味中的咸味可以入腎。故選擇用鹽制法對仙茅進行炮制,以期通過其引藥下行入腎的作用,來增強仙茅補腎壯陽、強筋健骨的作用。仙茅補肝腎、強筋骨的有效成分以酚苷類化合物為主,其中發揮補肝腎作用的有效成分之一為仙茅苷[12],《中國藥典》2020年版中規定以仙茅苷為指標性成分進行仙茅的質量控制;仙茅中含量較高的成分有苔黑酚龍膽二糖苷和苔黑酚葡萄糖苷等,其為仙茅發揮強筋骨作用的有效成分[13]。本實驗采用正交試驗設計法,以鹽水比例、悶潤時間、蒸制時間為考察因素,以仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物為評價指標,優選鹽蒸仙茅炮制工藝,以期為鹽蒸仙茅飲片的規范化、科學化、工業化生產奠定理論基礎。

1 材料

1.1 主要儀器C21-WT2118型電磁爐(美的集團股份有限公司);DFT-200型高速萬能粉碎機(浙江溫嶺市林大機械有限公司);Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司);XMTD-8222型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏試驗設備有限公司);AE240型電子分析天平(梅特勒-托利多公司);KQ-250E型醫用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);HH-4型數顯恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司);FA1004B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)等。

1.2 藥品與試劑仙茅苷對照品(批號:S0818AS,純度>98%);苔黑酚龍膽二糖苷對照品(批號:J1014AS,純度>98%)購自大連美侖生物技術有限公司;苔黑酚葡萄糖苷對照品(批號:1206A022,純度≥98%)購自北京索萊寶科技有限公司;黃酒(批號:20210119,酒精度10%)購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司;食鹽(批號:202204076)購自大連新春多品種鹽有限公司;乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純,其余試劑均為分析純,水為娃哈哈純凈水。

仙茅藥材(批號:2208001)購自安國市聚藥堂藥業有限公司,經遼寧中醫藥大學中藥鑒定室李峰教授鑒定為石蒜科植物仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 鹽制仙茅的制備

2.1.1 鹽炙法取生仙茅飲片20 g,置于密閉容器中,加入鹽水(食鹽:水=1∶15,每100 kg仙茅飲片用2 kg食鹽)拌勻,悶潤2 h,置于鍋中,110～120 ℃翻炒5 min,取出,放涼,即得[14]。

2.1.2 鹽蒸法取生仙茅飲片20 g,置于密閉容器中,加入鹽水(食鹽∶水=1∶17.5,每100 kg仙茅飲片用2 kg食鹽)拌勻,悶潤1 h,置于鍋中,蒸制1 h,取出放涼,50 ℃干燥,即得。

2.1.3 酒炙法取生仙茅飲片20 g,置于密閉容器中,加入黃酒(10%,即生仙茅飲片質量的10%)拌勻,悶潤,待黃酒被吸盡后,置于鍋中,以文火炒干,取出,放涼,即得[15]。

2.2 醇溶性浸出物的測定按《中國藥典》2020年版通則2201項下醇溶性浸出物測定法中的熱浸法進行測定[16]。

2.3 仙茅苷等3種成分的含量測定

2.3.1 色譜條件①仙茅苷:以Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱,以0.1%磷酸溶液-乙腈(76∶24,V/V)為流動相;流速1 mL·min-1;檢測波長210 nm;柱溫30 ℃;進樣量 10 μL[17]。②苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷:以Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱,以乙腈(A)-0.1% 磷酸溶液(B)為流動相進行梯度洗脫(0～7 min,95% B→90% B;7～20 min,90% B);流速0.6 mL·min-1;檢測波長220 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL[17]。

2.3.2 對照品溶液的制備精密稱取仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷對照品適量,分別加入甲醇溶解稀釋,混勻,制得仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷質量濃度分別為0.245 0、0.572 5、1.377 5 mg·mL-1的單一對照品母液[17]。

2.3.3 供試品溶液的制備取“2.1.2”項下鹽蒸仙茅樣品粉末(過三號篩,下同)1.0 g,精密稱定,加入甲醇50 mL,稱定質量,于水浴鍋中加熱回流2 h,取出放冷,再次稱定質量,用甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過[1]。精密量取上述濾液20 mL,蒸干,殘渣加入甲醇復溶,轉移至10 mL量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,搖勻,經0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得[1]。同法制得仙茅生品及鹽炙品的供試品溶液。

2.3.4 系統適用性試驗取上述各供試品溶液及單一對照品溶液適量,按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,詳見圖1。

A.仙茅苷對照品(色譜條件①);B.供試品溶液(色譜條件①);C.苔黑酚龍膽二糖苷對照品(色譜條件②);D.苔黑酚葡萄糖苷對照品(色譜條件②);E.供試品溶液(色譜條件②) 1.仙茅苷;2.苔黑酚龍膽二糖苷;3.苔黑酚葡萄糖苷圖1 各成分HPLC色譜圖

2.3.5 線性關系考察分別精密吸取“2.3.2”項下各單一對照品母液適量,用甲醇稀釋,制成仙茅苷質量濃度分別為7.70、15.30、30.60、61.30、122.50、245.00 μg·mL-1,苔黑酚龍膽二糖苷17.89、35.78、71.56、143.10、286.30、572.50 μg·mL-1,苔黑酚葡萄糖苷43.00、86.10、172.20、344.40、688.80、1 377.50 μg·mL-1的各單一對照品線性溶液,按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。以各待測成分進樣量(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸,計算各成分的回歸方程及線性范圍,結果見表1。

表1 各成分線性關系

2.3.6 精密度試驗分別精密吸取“2.3.2”項下各單一對照品溶液適量,按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6次。計算仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面積的RSD值,分別為0.44%、0.30%、0.27%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗取“2.3.3”項下供試品溶液(仙茅生品)適量,按“2.3.1”項下色譜條件進行測定,分別于0、2、4、8、12、24 h進樣。計算仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面積的RSD值,分別為0.13%、0.37%、0.21%(n=6),表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.3.8 重復性試驗取仙茅生品樣品粉末1.0 g,共6份,按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液,并按“2.3.1”項下色譜條件進行測定,計算仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的平均含量分別為0.099%、0.387%、0.649%,RSD值分別為0.36%、0.54%、0.30%(n=6),表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗精密稱取6份已知含量的同一批次仙茅樣品(生品)粉末,每份0.1 g,分別加入適量“2.3.2”項下各單一對照品溶液,按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液,并按“2.3.1”項下色譜條件進行測定,計算仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的平均加樣回收率分別為99.80%、95.94%、106.30%,RSD值分別為0.98%、1.61%、0.60%。

2.4 單因素試驗本研究選擇以鹽水比例、悶潤時間、蒸制時間進行單因素試驗;同時,參考相關文獻[13,16]確定各因素的權重,3種化學成分及醇溶性浸出物含量的權重均為25%。按以下綜合評分公式進行計算:綜合評分=(25%W/Wmax+25%X/Xmax+25%Y/Ymax+25%Z/Zmax)×100%。其中,W表示仙茅苷含量、X表示苔黑酚葡萄糖苷含量、Y表示苔黑酚龍膽二糖苷含量、Z表示醇溶性浸出物含量,Wmax表示仙茅苷含量的最大值、Xmax表示苔黑酚葡萄糖苷含量的最大值、Ymax表示苔黑酚龍膽二糖苷含量的最大值、Zmax表示醇溶性浸出物含量的最大值,綜合評分分值越高表示樣品質量越好[18]。

2.4.1 鹽水比例取生仙茅飲片,每份 20 g,共5份,加入不同比例鹽水(每100 kg生仙茅飲片,2 kg食鹽),至密閉容器內悶潤3 h后,蒸制1.5 h,取出放涼,50 ℃干燥?？疾觳煌}水比例(1∶5、1∶7、1∶10、1∶15、1∶20)對綜合評分的影響。結果,當鹽水比例為1∶15時,綜合評分最高,而鹽水比例1∶10存在鹽水與飲片無法完全拌勻的情況,鹽水比例1∶20存在鹽水無法完全吸盡的情況,故選擇鹽水比例為1∶15正交試驗設計,詳見表2。

表2 不同鹽水比例對綜合得分的影響

2.4.2 悶潤時間取生仙茅飲片,每份20 g,共5份,加入鹽水比例為1∶15,至密閉容器內悶潤不同時間后,蒸制1.5 h,取出放涼,50 ℃干燥?？疾觳煌瑦灊檿r間(1、2、3、4、5 h)對綜合評分的影響。結果表明,悶潤1 h時,綜合評分最高,其他時間分值相差不大,而悶潤時間少于1 h時存在不能完全潤透的情況,為節約時間,選擇以悶潤時間1～3 h進行正交試驗設計,詳見表3。

表3 不同悶潤時間對綜合得分的影響

2.4.3 蒸制時間取生仙茅飲片,每份 20 g,共5份,加入鹽水比例為1∶15,至密閉容器內悶潤1 h,蒸制不同時間,取出放涼,50 ℃干燥?？疾觳煌糁茣r間(1、1.5、2、2.5、3 h)對綜合評分的影響。結果表明,蒸制1 h時,綜合評分最高,其他時間分值相差不大,而蒸制時間少于1 h時存在不能完全蒸透的情況,為節約時間,選擇以蒸制時間1～2 h進行正交試驗設計,詳見表4。

表4 不同蒸制時間對綜合評分的影響

2.5 正交試驗

2.5.1 正交試驗設計以單因素試驗為基礎,本研究以鹽水比例(A)、悶潤時間(B)、蒸制時間(C)為考察因素,以仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷和醇溶性浸出物含量的綜合評分為評價指標,采用L9(34)正交表進行設計。酒蒸仙茅炮制工藝的因素與水平見表5,試驗設計方案與結果見表6,方差分析結果見表7。

表5 正交試驗因素水平表

表6 正交試驗設計方案與結果

表7 正交試驗方差分析

由表6可知,各因素對醇溶性浸出物及3種化學成分含量影響的大小順序依次為B>A>C,最優組合為A3B1C1。由表7可知,因素A、B、C無顯著影響(P>0.05),最終確定最優工藝為A3B1C1,即鹽水比例1∶17.5、悶潤時間1 h、蒸制時間1 h。

2.5.2 驗證試驗取生仙茅飲片,每份100 g,共3份,按上述最優鹽蒸炮制工藝制備3份鹽蒸仙茅樣品,按“2.2”“2.3”項下方法分別測定含量,并計算綜合得分,結果見表8。綜合評分RSD值為1.62%,表明所得最優鹽蒸仙茅工藝穩定、可行。

表8 驗證試驗結果

2.6 仙茅生品、鹽炙品、鹽蒸品及酒炙品含量比較取生仙茅飲片 20 g,按“2.1.1”“2.1.2”“2.1.3”項下方法分別制備鹽炙品、鹽蒸品和酒炙品,再按“2.2”“2.3”項下方法測定生仙茅飲及3種炮制品中醇溶性浸出物及仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的含量,結果見表9。結果顯示,鹽蒸仙茅的醇溶性浸出物及仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量均高于仙茅生品、鹽炙品和酒炙品。

表9 仙茅生品、鹽炙品、鹽蒸品及酒炙品含量比較

3 討論

目前,對鹽制仙茅的研究較少,有鹽炙法和鹽蒸法,其經鹽制后的炮制機理和化學成分變化等尚不明確。鹽制中藥的方法最早于《雷公炮炙論》中就有所記載。經過歷朝歷代的不斷發展創新,鹽制飲片品種有所增加。沿用至今的方法多為鹽炙法和鹽蒸法,但鹽炙法存在火力不均、火候難以控制等問題,而鹽蒸法則能使飲片受熱均勻,且由于其操作過程中處于密閉環境,減少了對飲片的污染。故本研究選擇對鹽蒸仙茅炮制工藝進行研究,以期提高臨床療效和用藥安全性,為臨床用藥提供新思路。

本研究經實驗考察,并以本課題組前期研究為參考[17],發現以“2.3.1”項下色譜條件測定仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量時,其色譜峰分離度較好、基線較為平穩。故選擇以“2.3.1”項下色譜條件對其進行檢測。

酚苷類成分是仙茅發揮補肝腎、強筋骨作用的物質基礎[19],故本研究將醇溶性浸出物含量作為考察指標,同時選擇《中國藥典》2020年版中仙茅含量測定所規定的指標成分仙茅苷及仙茅酚苷類成分中含量較高的苔黑酚龍膽二糖苷和苔黑酚葡萄糖苷作為評價指標,以鹽水比例、悶潤時間、蒸制時間為考察因素,結合綜合加權評分對工藝進行優化,得到仙茅鹽蒸最佳工藝為取生仙茅飲片適量,置于密閉容器內,加入鹽水(鹽水比例1∶17.5,每100 kg仙茅飲片用 2 kg食鹽)拌勻,悶潤1 h,置于鍋中蒸制1 h,取出放涼,50 ℃干燥,即得。經驗證,結果表明所得最優鹽蒸仙茅炮制工藝具有一定的科學性與可行性。隨著中藥炮制技術的演變,炮制工藝也在不斷改進,炮制方法不斷創新。但由于炮制工藝變化較大,中藥成分較為復雜,本研究后續尚需對其質量標準、藥理實驗、化學成分分析、臨床療效等進行更深入的研究。