HPLC多波長(zhǎng)切換指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)研究白術(shù)土炒前后成分變化規(guī)律

張磊,任榕霞,丁寧,崔偉亮,李慧芬

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;2.濟(jì)南市企業(yè)技術(shù)進(jìn)步促進(jìn)中心,山東 濟(jì)南 250102;3.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250101;4.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 臨沂 276005)

白術(shù)為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)干燥根莖,具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的作用,用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等癥[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品[2]。白術(shù)土炒后增強(qiáng)健脾止瀉的作用,多用于脾虛泄瀉。《外臺(tái)秘要》始載白術(shù)土炒的炮制方法[3],現(xiàn)代保留的白術(shù)主要炮制方法有麩炒法、土炒法及清炒法。白術(shù)經(jīng)炒制后化學(xué)成分發(fā)生了不同程度的變化,白術(shù)化學(xué)成分研究主要集中于揮發(fā)油類、內(nèi)酯類、多糖類等成分,土白術(shù)中化學(xué)成分研究主要集中于倍半萜和聚乙炔類成分[4]。目前,對(duì)白術(shù)及麩白術(shù)HPLC指紋圖譜的研究較多,未檢索到對(duì)土白術(shù)水溶性成分及脂溶性成分測(cè)定的報(bào)道[5-10]。為了系統(tǒng)分析土炒對(duì)白術(shù)成分變化的影響,本研究建立同時(shí)測(cè)定白術(shù)、土白術(shù)水溶性成分及脂溶性成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)多波長(zhǎng)切換指紋圖譜方法,并進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,篩選白術(shù)、土白術(shù)的主要差異性成分,研究白術(shù)土炒前后化學(xué)成分變化規(guī)律,為進(jìn)一步規(guī)范白術(shù)土炒炮制工藝,制定土白術(shù)專屬性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),研究土白術(shù)炮制原理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters 2998 Photodiode Array Detector 高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);Mettler Toledo XSE 205電子天平(美國(guó)梅特勒托利多公司);Synergy UV超凈水儀(美國(guó)密理博公司)。

1.2 試劑新綠原酸對(duì)照品(批號(hào):MUST-19031001)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司;綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品(批號(hào)依次為:110753-201716、111975-201501、111976-201501、111978-201501)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;蒼術(shù)酮對(duì)照品(批號(hào):J09GB151099)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;水為自制超純水;其余試劑均為分析純。

1.3 試藥本研究從安徽盛海堂中藥飲片有限公司和安國(guó)市聚藥堂中藥飲片有限公司購(gòu)置白術(shù)飲片共17批(編號(hào)為S1～S17),具體見(jiàn)表1。

分別委托兩家企業(yè)根據(jù)《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》2012年版一部土白術(shù)炮制方法[11],取伏龍肝細(xì)粉,置鍋內(nèi)中火炒至呈靈活狀態(tài)時(shí),加入凈白術(shù)片,拌炒至表面掛土色,有香氣逸出時(shí),取出,篩去伏龍肝細(xì)粉,放涼,每100 kg白術(shù)片,用伏龍肝細(xì)粉20 kg。制備了土白術(shù)(編號(hào)記為T1～T17)。

經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定,樣品分別為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)干燥根莖切制的厚片和土炒飲片。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Kromasil 100-5 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);進(jìn)樣體積為10 μL;流速為0.8 mL·min-1;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)0～11 min,290 nm;11～26 min,327 nm(新綠原酸、綠原酸);26～50 min,220 nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、Ⅱ);50～59 min,270 nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ);59～67min,220 nm(蒼術(shù)酮)。梯度洗脫(0～10 min,7% A→10% A;10～25 min,10% A→18% A;25～35 min,18% A→55% A;35～37 min,55% A→65% A;37～49 min,65% A→68% A;49～52 min,68% A;52～53 min,68% A→95% A;53～67 min,95% A)。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備分別取新綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含新綠原酸40.27 μg、綠原酸27.32 μg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 109.30 μg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ 101.42 μg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 92.60 μg、蒼術(shù)酮 31.44 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備精密稱定樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)1.0 g,置具塞三角瓶中,精密加入80%甲醇25 mL,蓋塞稱重,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)30 min,補(bǔ)足失重,過(guò)濾,濾液再以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 指紋圖譜的建立及共有峰的確定取各樣品按照“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,將測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版)”進(jìn)行Mark峰匹配和多點(diǎn)矯正,分別建立白術(shù)、土白術(shù)HPLC指紋圖譜,白術(shù)共標(biāo)識(shí)出9個(gè)共有峰(見(jiàn)圖1),土白術(shù)共標(biāo)識(shí)出10個(gè)共有峰(見(jiàn)圖2)。分別以S1、T1樣品指紋圖譜為參照?qǐng)D譜,生成白術(shù)、土白術(shù)對(duì)照指紋圖譜。通過(guò)對(duì)照品(見(jiàn)圖3)比對(duì),根據(jù)對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì)并結(jié)合紫外光譜圖,確定2號(hào)峰為新綠原酸,3號(hào)峰為綠原酸,4號(hào)峰(S峰)為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ,8號(hào)峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ,9號(hào)峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ,10號(hào)峰為蒼術(shù)酮。

圖1 白術(shù)HPLC指紋圖譜

圖2 土白術(shù)HPLC指紋圖譜

2.4.2 參照峰選擇本試驗(yàn)以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為參照峰,用于計(jì)算指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.4.3 精密度試驗(yàn)取土白術(shù)(T1)的供試品溶液,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ色譜峰為參照峰S,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值范圍為0.03%～0.94%,相對(duì)峰面積RSD值范圍為0.45%～4.08%。表明儀器精密度符合要求。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取土白術(shù)(T1)的供試品溶液,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣,以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ色譜峰為參照峰S,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值范圍為0.03%～0.92%,相對(duì)峰面積RSD值范圍為0.45%～3.95%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)取土白術(shù)(T1)粉末,按照“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液,平行制備6份,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ色譜峰為參照峰S,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值范圍為0.03%～1.01%,相對(duì)峰面積RSD值范圍為0.49%～4.08%,表明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜相似度分析采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版)”軟件,分別計(jì)算各批樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度,結(jié)果見(jiàn)表2。白術(shù)指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍在0.928～0.996,土白術(shù)樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍在0.900～0.994,表明白術(shù)、土白術(shù)不同飲片各批次之間相似度高。

表2 白術(shù)、土白術(shù)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.6.1 聚類分析(HCA分析)將白術(shù)、土白術(shù)共有峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件,進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,白術(shù)可聚為一類,土白術(shù)中T2、T7、T9歸為白術(shù)一類,其余土白術(shù)樣品可聚為一類。

圖4 白術(shù)、土白術(shù)聚類分析圖

2.6.2 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA分析)為了進(jìn)一步篩選對(duì)兩種飲片產(chǎn)生影響貢獻(xiàn)較大的成分,采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行有監(jiān)督模式識(shí)別分析,建立OPLS-DA分析模型,表示模型在X軸、Y軸方向上對(duì)變量解釋能力的R2X(cum)=0.770,R2Y(cum)=0.748,表示模型分組預(yù)測(cè)能力的Q2(cum)=0.542,表明所建立模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測(cè)能力強(qiáng),可用于區(qū)別白術(shù)、土白術(shù)。OPLS-DA得分圖顯示(見(jiàn)圖5A),白術(shù)和土白術(shù)可以被有效區(qū)分,表明白術(shù)土炒前后化學(xué)成分有明顯差異。

圖5 白術(shù)、土白術(shù)OPLS-DA模型得分圖(A)、模型檢驗(yàn)圖(B)、Biplot圖(C)、S-plot圖(D)

OPLS-DA檢驗(yàn)圖顯示(見(jiàn)圖5B),經(jīng)200次排列檢驗(yàn),右側(cè)R2>0.75、Q2>0.54,Q2-回歸線的截距=-0.545,排列檢驗(yàn)確保了模型沒(méi)有過(guò)度擬合,因此,所建立的模型是可靠、準(zhǔn)確的。

Biplot圖(見(jiàn)圖5C)中共有峰分布的位置表明其對(duì)2組樣品分組相應(yīng)的貢獻(xiàn)率[10]。其中,4號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)、1號(hào)峰對(duì)土白術(shù)分組貢獻(xiàn)率最大,7號(hào)峰、8號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ)、9號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ)、6號(hào)峰、10號(hào)峰(蒼術(shù)酮)對(duì)白術(shù)分組貢獻(xiàn)率最大。

S-plot圖(見(jiàn)圖5D)中的縱坐標(biāo)P(corr)代表每個(gè)組分的相關(guān)系數(shù),距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的組分,對(duì)分組的貢獻(xiàn)越大[12]。故各變量對(duì)分組貢獻(xiàn)度由大到小為:峰1[P(corr)=0.676],峰10[蒼術(shù)酮P(corr)=-0.644],峰6[P(corr)=-0.544],峰4[白術(shù)內(nèi)酯ⅢP(corr)=0.518],峰5[P(corr)=-0.510]。

以峰編號(hào)為橫坐標(biāo),以表明變量重要性的投影值(variable important in project,VIP)為縱坐標(biāo)得到VIP圖(見(jiàn)圖6)。一般認(rèn)為VIP值大于1的成分為主要差異成分,VIP值越高,對(duì)區(qū)分兩種樣品的貢獻(xiàn)率越高。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知,10號(hào)峰(蒼術(shù)酮)、1號(hào)峰、6號(hào)峰、5號(hào)峰、4號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)的VIP大于1。

圖6 白術(shù)、土白術(shù)VIP圖(D)

結(jié)合Biplot圖、VIP圖與S-plot圖,以VIP>1和P(corr)的絕對(duì)值大于0.6為標(biāo)準(zhǔn),篩選出對(duì)模型分組影響最大的變量10號(hào)峰(蒼術(shù)酮)、1號(hào)峰、6號(hào)峰、5號(hào)峰、4號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)。

3 小結(jié)與討論

本研究以色譜峰的個(gè)數(shù)、峰形及分離效果為指標(biāo),分別對(duì)提取溶劑(不同濃度甲醇、乙醇、水)、提取方法(加熱回流、超聲)進(jìn)行了系統(tǒng)考察,采用全波長(zhǎng)掃描選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng),優(yōu)選的最佳實(shí)驗(yàn)條件為:80%甲醇超聲法提取樣品,色譜條件為色譜柱:Kromasil 100-5 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液;多波長(zhǎng)切換:0～11 min,290 nm,11～26 min,370 nm(新綠原酸、綠原酸),26～50 min,220 nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ),50～59 min,270 nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ),59～67 min,220 nm(蒼術(shù)酮);流速為0.8 mL·min-1;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。建立的HPLC-DAD多波長(zhǎng)切換指紋圖譜測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠,能夠系統(tǒng)地分析白術(shù)土炒前后化學(xué)成分的變化規(guī)律。

對(duì)比色譜圖可知,土炒后1號(hào)峰、4號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)、8號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ)峰面積增加,2號(hào)峰(新綠原酸)、3號(hào)峰(綠原酸)、5號(hào)峰、6號(hào)峰、7號(hào)峰、9號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ)、10號(hào)峰(蒼術(shù)酮)土炒后峰面積均降低。通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,10號(hào)峰(蒼術(shù)酮)、1號(hào)峰、6號(hào)峰、5號(hào)峰、4號(hào)峰(白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)為白術(shù)與土白術(shù)的顯著差異性成分。白術(shù)可聚為一類,土白術(shù)中T2、T7、T9被歸為白術(shù)一類,其余土白術(shù)樣品可聚為一類,推測(cè)原因可能是這3批土白術(shù)炮制程度稍欠,導(dǎo)致無(wú)法對(duì)白術(shù)與土白術(shù)進(jìn)行有效區(qū)分。結(jié)果提示,現(xiàn)有的炮制工藝尚不夠精細(xì),炮制溫度與時(shí)間需要進(jìn)一步細(xì)化和規(guī)范,以便更加有效保證土白術(shù)的質(zhì)量穩(wěn)定性。1號(hào)峰為土白術(shù)重要的專屬性成分,試驗(yàn)中曾以5-羥甲基糠醛、隱綠原酸、異綠原酸等對(duì)照品進(jìn)行了比對(duì)分析并查閱相關(guān)文獻(xiàn),但仍未能其代表的化學(xué)成分。根據(jù)紫外光譜圖推測(cè),該成分可能為小分子脂肪酸類成分,課題組在后續(xù)試驗(yàn)中,將進(jìn)一步采用成分分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定等相關(guān)技術(shù)明確該成分,同時(shí)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究白術(shù)與土白術(shù)功效差異與成分差異的關(guān)系。