雞血藤纖維樣物質藥用價值的研究與評價

吳國學,武天坤,李小霞,楊書婷,劉棟,董靖,張思森,郝義彬,王一碩

[1.河南中醫藥大學第五臨床醫學院(鄭州人民醫院),河南 鄭州 450003;2.河南省人民醫院,河南 鄭州 450000;3.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046]

雞血藤是豆科植物密花豆的干燥藤莖,在傳統中醫中已有數百年的歷史,主產于中國的廣東、廣西和東南亞一些國家,具有活血補血、調經止痛、舒筋活絡等功效[1-3]。雞血藤含有多類化學成分,其中黃酮類成分兒茶素、表兒茶素等化學成分是雞血藤發揮抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護心腦血管、降血糖和調節內分泌等多種藥理作用的物質基礎[4-5]。但在臨床應用中,經常需要將雞血藤飲片粉碎,過篩后的細粉用于制丸或制顆粒,但粉碎時會產生大量纖維樣殘渣,不易過篩,這部分入丸劑會導致丸劑表面粗糙,影響患者服用口感,且纖維樣殘渣中的化學成分及含量尚不明確,為明確雞血藤粉碎過程中未能過篩的纖維樣物質是否具有回收再利用價值而進行了該研究,以期為以后同類型的中藥飲片的粉碎回收利用提供參考依據。

1 儀器與試藥

F-30B型萬能粉碎機及不同目數的工業篩;3號、4號、5號、6號藥典篩;TL-650CT型超聲提取儀;高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀(Agilent1200系列);甲醇、乙腈為色譜純,雙蒸水為超純水,磷酸為分析純。兒茶素對照品(江蘇永健醫藥科技有限公司,批號200029-160914)。雞血藤樣品為采購自6個不同廠家、包裝規格為1 kg的雞血藤飲片,由河南中醫藥大學張振凌老師鑒定為雞血藤正品。

2 方法與結果

2.1 粉碎及過篩

2.1.1粉碎

不同廠家的6 袋雞血藤飲片分別編號,掰成小塊、不裝篩網,直接用萬能粉碎機粉碎打成小塊(預粉碎)。將預處理的每份樣品粗塊分成兩份,每份約500 g,分2次過20 目工業篩,中間要將未能過篩的纖維掏出,分裝已過20目工業篩的粗粉和未過20 目工業篩的纖維,并分別標號。再將已過20目工業篩的粗粉、未過20目工業篩的纖維依次過80目工業篩,收集最終過80目工業篩的細粉和不能過80目工業篩的纖維樣物質,分別稱重。結果表明雞血藤飲片使用萬能粉碎機粉碎過80 目工業篩產生平均84.9%細粉和15.1%的纖維樣物質,兩部分的重量和占比詳見表1。

表1 雞血藤飲片經萬能粉碎機粉碎后細粉、纖維樣物質產出情況

2.1.2過篩

將“2.1.1”項粉碎后過80目工業篩的細粉、纖維樣物質再過6號藥典篩(100目)。為了取樣的科學性,采用均等四分法、對角線取樣。分別稱量上述過80目工業篩的原細粉經6號藥典篩過篩后產生的細粉、纖維樣物質重量,稱量上述不能過80目工業篩的原纖維樣物質經6號藥典篩過篩后產生的細粉、纖維樣物質重量,并計算各自的占比,結果見表2、表3。

表2 原細粉經6號藥典篩過篩后細粉和纖維樣物質 重量及占比

從表2、表3可知,經過80目工業篩產生的細粉,再用6號藥典篩(100目)過篩,篩下來的細粉占比72.1%,纖維樣物質占比27.9%;而不能經過80目工業篩產生的纖維樣物質,再用6號藥典篩(100目)過篩,篩下來的細粉占比26.9%,纖維樣物質占比73.1%。

表3 原纖維樣物質經6號藥典篩過篩后細粉和 纖維樣物質重量及占比

2.2 浸出物測定

按《中國藥典》2020年版四部“2201 浸出物測定法”[6]測定“2.1.2”項所得細粉、纖維樣物質(批次1)的浸出物含量。取供試品約2 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶中,精密加乙醇50 mL,密塞,稱定重量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。放冷后,取下錐形瓶,密塞,再稱定重量,用乙醇補足減失的重量,搖勻,用干燥濾器濾過,精密量取濾液25 mL,置已干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴上蒸干,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量。以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物含量。結果顯示,無論是過80目工業篩,還是過6號藥典篩,所得細粉的乙醇浸出物含量均遠高于纖維樣物質,見表4。

表4 浸出物測定結果

2.3 水分測定

按《中國藥典》2020年版四部“0832 水分測定法”第二法(烘干法)[6]測定“2.1.2”項所得細粉、纖維樣物質(批次1)的水分含量。取供試品2～5 g,平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中,厚度不超過5 mm,精密稱定,開啟瓶蓋在100～105 ℃干燥5 h,將瓶蓋蓋好,移置干燥器中,放冷30 min,精密稱定,再在上述溫度干燥1 h,放冷,稱重,至連續兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據減失的重量,計算供試品中含水量(%)。結果顯示,無論是過80目工業篩,還是過6號藥典篩,所得細粉、纖維樣物質的水分含量均未有明顯差別,并且都符合藥典中雞血藤飲片項水分含量限值要求(不得過13.0%)。見表5。

表5 水分測定結果

2.4 含量測定

2.4.1色譜條件

色譜柱:Agilent C18柱(4.6 mm×100 mm,2.6 μm)。流動相:乙腈-0.2%磷酸溶液(10∶90);流速為1.3 mL·min-1;柱溫為25 ℃;檢測波長為278 nm;進樣量為10 μL;理論板數按兒茶素峰計算應≥3 000。

2.4.2對照品溶液的制備

取兒茶素對照品適量,精密稱定,用50%(體積分數)甲醇溶解并定容至刻度,制成含兒茶素0.12 g·L-1的對照品溶液。配置好的對照品溶液放置于冰箱中,防止氧化變質。

2.4.3供試品溶液的制備

取本品粉末約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率100 W,頻率50 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,加50%甲醇補足減失的重量,濾過,濾液蒸干,殘渣用50%甲醇溶解并轉移至2 mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.4.4系統適用性試驗

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL,在上述色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,見圖1、圖2。結果顯示,兒茶素與相鄰成分分離度良好(>1.5),理論板數按兒茶素峰計算>3 000。

HPLC為高效液相色譜。

HPLC為高效液相色譜。

2.4.5線性關系考察

取“2.4.2”項兒茶素對照品溶液(0.12 g·L-1),在上述色譜條件下依次進樣5、10、15、20、25 μL,記錄色譜圖,測定峰面積。以峰面積(y)對進樣量(x)進行線性回歸,得回歸方程y=334 542x-8 318.3,相關系數r=1。結果表明在0.6～3.0 μg范圍內,兒茶素峰面積與進樣量線性關系良好。詳見表6。

表6 線性關系考察結果

2.4.6精密度試驗

取“2.4.3”項同一供試品溶液,按上述色譜條件下,連續進樣6次,記錄色譜峰峰面積和保留時間。結果顯示兒茶素峰保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.31%,峰面積的RSD為0.82%,表明儀器精密度良好。見表7。

表7 精密度試驗結果

2.4.7重復性試驗

取同一批雞血藤飲片細粉,按“2.4.3”項方法平行制備6份供試品溶液,然后按上述色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,并計算兒茶素含量。結果顯示,兒茶素的平均含量為0.198 7 mg·g-1,RSD為1.89%,表明上述方法重復性良好。見表8。

表8 重復性試驗兒茶素含量

2.4.8穩定性試驗

取“2.4.3”項同一供試品溶液,在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時,按上述色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。結果顯示,兒茶素峰面積的RSD為1.63%,表明供試品溶液配制后室溫下放置12 h內穩定性良好。見表9。

表9 重復性試驗結果

2.4.9回收率試驗

取同一批已知兒茶素含量的雞血藤飲片細粉6份,每份約0.5 g,精密稱定,分別加入相當于100%水平的兒茶素對照品,按“2.4.3”項方法制備供試品溶液,然后按上述色譜條件進樣測定,記錄色譜圖并計算得出兒茶素含量為1.79%,平均RSD為99.32%,見表10。

表10 兒茶素加樣回收率試驗結果

2.4.10樣品中兒茶素含量測定

取以下6種樣品:(1)“2.1.1”項雞血藤飲片用萬能粉碎機粉碎、經80目工業篩過篩后所得的原細粉、原纖維樣物質;(2)“2.1.2”項原細粉經6號藥典篩(100目)過篩后產生的細粉、纖維樣物質;(3)“2.1.2”項原纖維樣物質經6號藥典篩(100目)過篩后產生的細粉、纖維樣物質。分別按“2.4.3”項方法制備供試品溶液,然后上述色譜條件進樣測定,記錄色譜圖并計算兒茶素含量。結果見表11。

表11 雞血藤飲片粉碎后各過篩樣品中兒茶素含量 測定結果(mg·g-1)

3 討論

3.1 課題研究目的

雞血藤是活血養血常用中藥,臨床常用于治療月經不調、血虛萎黃、麻木癱瘓、風濕痹痛等,為“血分之圣藥”,其主要活性成分為黃酮類(如兒茶素)[5]。經文獻檢索,有關雞血藤化學成分含量測定、提取分離、藥理的研究較多,但對雞血藤粉碎后未能過篩的纖維樣物質尚未有研究,為明確其是否具有再回收利用價值進行了該項研究。

3.2 雞血藤飲片粉碎后過篩研究

雞血藤飲片用萬能粉碎機粉碎后,產生了大約15.1%的纖維樣物質。上述纖維樣物質再分別用3號、4號、5號藥典篩過篩,發現過篩后細粉中纖維樣物質仍然較多。最后采用6號藥典篩(100 目)過篩,發現纖維樣物質較少,故“2.1.2”項的過篩過程采用6號篩。

3.3 含量測定指標成分的選擇

陸雪麗等[7]用HPLC法對雞血藤中的主要有效成分兒茶素和表兒茶素總量進行了測定;譚瀟等[8]對雞血藤乙醇提取物及其活性成分兒茶素的抗輻射作用進行了研究,并探討了初步作用機制;張敏等[9]用快速液相色譜法同時測定了雞血藤藥材中原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素的含量;劉超等[10]建立了雞血藤中兒茶素類化合物的含量測定方法;Lee等[11]研究了雞血藤提取物的抗血小板作用機制;劉屏等[12]提取了雞血藤中的兒茶素類成分,發現其在血液系統方面對造血祖細胞內源性增殖缺陷有緩解作用,是雞血藤發揮補血活血的重要物質基礎。上述研究均表明兒茶素是雞血藤飲片中含量較高的黃酮類成分,也是其發揮補血活血藥效的主要成分,還是雞血藤指紋圖譜中的特征成分,所以本研究將兒茶素作為本研究的指標成分。

3.4 含量測定用供試品溶液制備方法的選擇

在選擇提取溶劑時,考慮到乙醇提取液中雜質較多,可能會對兒茶素含量測定產生影響。在查閱相關文獻[13-15]的基礎上,選用50%甲醇作為提取溶劑。在提取方式上,超聲提取比回流提取方便快捷,且不會因為加熱導致供試品中成分發生變化,故選擇超聲提取。

3.5 雞血藤飲片粉碎后各過篩樣品中兒茶素含量差異分析

從表9可知,兒茶素含量在各過篩樣品的細粉和纖維樣物質中差異顯著。經計算三批樣品中,原細粉和原纖維樣物質中兒茶素含量比值分別為1.65、1.37、1.43;原細粉過6號藥典篩后產生的細粉和纖維樣物質中兒茶素含量比值為1.52、1.56、1.46;原纖維樣物質過6號藥典篩后產生的細粉和纖維樣物質中兒茶素含量比值為1.51、1.63、1.34。

4 結論

在制藥過程中,雞血藤飲片經常要打粉,會產生很多纖維樣物質,直接用于制顆粒、制丸,患者反映口感較差。經上述研究表明,雞血藤飲片經萬能粉碎機粉碎后產生大約15.1%的纖維樣物質;萬能粉碎機粉碎后過6號藥典篩,篩下來的細粉中含有的纖維樣物質較少,適宜制藥;各過篩樣品細粉和纖維樣物質中水分含量基本一致,均符合藥典要求;各過篩樣品細粉的乙醇浸出物含量均遠高于相應的纖維樣物質;各過篩樣品細粉的兒茶素含量是相應纖維樣物質的1.34～1.65倍。綜合如上研究結果,雞血藤飲片經萬能粉碎機粉碎,再過6號藥典篩后,篩分下來的纖維樣物質可以舍棄。

在臨床使用過程中,千年健、烏藥、甘草等眾多中藥飲片經粉碎后也會產生大量纖維樣物質,本文的研究結果給這類飲片的后處理提供了一定的參考依據。