mNGS在非HIV感染慢性腎臟病患者并發(fā)耶氏肺孢子菌肺炎中的診斷價值

任亞茹,王維秀,李玉葉,王秋義,于國瑋,胡鵬,張磊,劉美蓉,楊定位

(1.天津大學(xué)天津醫(yī)院 a.腎內(nèi)科;b.感染疾病科,天津 300000;2.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,天津 300000)

耶氏肺孢子菌肺炎(pneumocystis jirovecii pneumonia,PJP)是一種機(jī)會性的肺部真菌感染,通常見于免疫力低下人群,其中,相較于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者,終末期腎病患者、移植后患者、血液病患者及腫瘤患者等非HIV感染者的發(fā)病率正在升高,且據(jù)相關(guān)報道,此類患者PJP的病原體診斷敏感性較低,但臨床癥狀嚴(yán)重,疾病發(fā)展更快,病死率更高[1]。

耶氏肺孢子菌是一種非典型真菌,無法在體外培養(yǎng)。目前,診斷PJP的金標(biāo)準(zhǔn)為呼吸道標(biāo)本染色后顯微鏡下找特征性囊腫或滋養(yǎng)層細(xì)胞[2]。但由于標(biāo)本真菌負(fù)荷量較低等原因,檢測結(jié)果常表現(xiàn)為假陰性,而其他檢測方法如PCR存在價格昂貴、需要特定引物等局限性,這使得PJP的早期診斷受到一定限制[3]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)作為一種高通量測序技術(shù),在臨床病原體診斷方面的價值已逐步被認(rèn)可。mNGS可同時對多個單獨(dú)的DNA/RNA分子進(jìn)行并行測序,再借助較為準(zhǔn)確、全面的數(shù)據(jù)庫,對比檢測出多種類型的微生物(包括細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲等)[4-11],檢測時間也縮短至24～48 h[12-13]。據(jù)臨床報道,在進(jìn)行病原體檢測時,mNGS的確有較高的陽性率,且對于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)陰性的標(biāo)本,mNGS仍可得出準(zhǔn)確的陽性結(jié)果[9-10,14-15]。

本研究通過mNGS輔助診斷了9例并發(fā)PJP的非HIV感染的慢性腎臟病(chronic kidney diseases,CKD)患者,檢測時間最終控制在24～36 h,且其中6例通過針對性抗感染治療病情好轉(zhuǎn),這均證實(shí)了mNGS在PJP診斷中的重要作用。報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究是一項回顧性研究,納入2019年9月10日至2022年8月21日天津大學(xué)天津醫(yī)院腎內(nèi)科收治的疑診發(fā)生了PJP的10例CKD患者。在收取標(biāo)本前,這些患者均已使用過抗生素。

1.2 研究方法

1.2.1資料收集

采用回顧性分析的方法收集了患者的性別、年齡、基礎(chǔ)疾病等一般資料及患者癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、診治過程、預(yù)后等臨床數(shù)據(jù)。

1.2.2標(biāo)本收集及檢測

收取的標(biāo)本包括痰液和肺泡灌洗液,所有標(biāo)本均使用mNGS和傳統(tǒng)微生物檢測方法進(jìn)行病原體檢測。進(jìn)行mNGS檢測的標(biāo)本量均不少于3 mL,由采集人員在嚴(yán)格遵守?zé)o菌觀念的情況下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序采集到相應(yīng)的無菌容器中。樣本容器為無菌、干燥的凍存管,內(nèi)含特殊脫氧核糖核酸保護(hù)劑。標(biāo)本在-29 ℃條件下運(yùn)輸,留存時間均不得超過1周[16-17]。同時采集等量的標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)及涂片鏡檢,但放置容器為傳統(tǒng)帶蓋無菌尿檢杯,在常溫條件下送至天津大學(xué)天津醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室[18-19],并由天津大學(xué)天津醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室專業(yè)人員對收取的標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)。

mNGS檢測的以下流程均由華大基因和金域檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)的專業(yè)人員進(jìn)行:將行mNGS 的標(biāo)本根據(jù)標(biāo)本類型不同進(jìn)行了相應(yīng)的預(yù)處理后,使用TIANamp微型DNA試劑盒(天根生化有限公司)從樣本中提取DNA,通過基因測序儀對DNA進(jìn)行測序,最終所測得的序列數(shù)據(jù)是去除了低質(zhì)量序列、污染核酸序列、重復(fù)讀取序列等的高質(zhì)量序列,再過濾掉人類基因組序列后得到病原體相關(guān)DNA序列,將其與病原體DNA數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行比對,得出最終的疑似病原體名單[9,13,20-21]。此外,所提取的DNA在進(jìn)行酶切、末端修復(fù)、適配器連接等步驟后可用于建立基于北京基因組學(xué)研究所測序儀-100的DNA文庫。

1.2.3診斷標(biāo)準(zhǔn)

在進(jìn)行回顧性分析時,患者需同時滿足CKD及PJP的診斷標(biāo)準(zhǔn),其中CKD診斷主要是根據(jù)2012年改善全球腎臟病預(yù)后組織指南中CKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[22]。符合下列任意情況之一,持續(xù)時間≥3個月。(1)腎臟損害標(biāo)志:①白蛋白尿(24 h尿微量白蛋白定量>30 mg,尿白蛋白肌酐比值>30 mg·g-1或>3 g·mol-1);②尿沉渣異常;③小管功能障礙導(dǎo)致的電解質(zhì)或其他異常;④組織學(xué)檢測到的異常;⑤影像學(xué)檢查異常;⑥有腎移植史。(2)腎小球?yàn)V過率降低(<60 mL·min-1·1.73 m-2)。而PJP診斷則是基于臨床醫(yī)生對患者的檢驗(yàn)檢查結(jié)果、影像學(xué)表現(xiàn)、臨床表現(xiàn)及最終治療效果等的綜合評判。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究納入的患者均為疑似發(fā)生了PJP的CKD患者,共10例,其中男6名,女4名,年齡(48.80±13.27)歲;所有患者均有腎臟基礎(chǔ)疾病,且均有不同程度的免疫抑制,其中9例有激素及免疫抑制劑使用史,使用時間2～24個月不等。收取的樣本為痰液和肺泡灌洗液,其中痰液7例,肺泡灌洗液3例,見表1。

表1 患者一般資料

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

所有患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果見表2,其中炎癥指標(biāo)表現(xiàn)異常的包括白細(xì)胞計數(shù)升高(70%)、中性粒細(xì)胞比值升高(100%)、C反應(yīng)蛋白升高(100%);所有患者均有不同程度的免疫抑制,相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞計數(shù)及白蛋白計數(shù)的降低;腎功能異常的患者為100%;其余異常表現(xiàn)為G試驗(yàn)陽性(70%)、氧合指數(shù)≤300(70%)及乳酸脫氫酶升高(100%)。患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果均不具有特異性。病原學(xué)檢測方面,傳統(tǒng)微生物檢測的異常結(jié)果包括涂片結(jié)果陽性(50%)、培養(yǎng)結(jié)果陽性(40%),陽性率均低于mNGS(100%),見表3。

表2 患者實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計

表3 患者病原學(xué)檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.3 診治過程及預(yù)后

在進(jìn)行mNGS檢測前,所有患者均擬診PJP。根據(jù)患者癥狀、體征及相關(guān)化驗(yàn)檢查,最終有9例患者確診為PJP,這9例患者均通過mNGS檢測到耶氏肺孢子菌,而傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)耶氏肺孢子菌,涂片也均未發(fā)現(xiàn)耶氏肺孢子菌特征性囊腫及滋養(yǎng)層細(xì)胞等征象。9例PJP患者中有7例在mNGS檢測前即經(jīng)驗(yàn)性使用了復(fù)方磺胺甲噁唑片(sulfamethoxazole-trimethoprim,SMZ-TMP)和(或)卡泊芬凈,最終有4例患者取得臨床癥狀及影像學(xué)檢查征象的好轉(zhuǎn),其余3例治療無效死亡,這3例患者均在肺感染早期即發(fā)生了呼吸衰竭,見表4。

表4 患者的診治過程

3 討論

PJP是一種機(jī)會性的真菌感染,易感人群為具有任何可改變機(jī)體免疫力的潛在疾病或相關(guān)危險因素的患者,包括高齡、癌癥、HIV、移植術(shù)后狀態(tài)及有激素或(和)免疫抑制劑服用史等的患者。由于廣泛使用預(yù)防及抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法,HIV人群相關(guān)的PJP發(fā)病率已大幅下降[23];與此同時,非HIV患者的PJP發(fā)病率卻在逐年升高[24-25]。而在非HIV 的患者中,發(fā)生PJP最重要的危險因素就是聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑[23,26]。本研究10例病例中,最終9例確診了PJP,而這些患者均有激素及免疫抑制劑使用史,是發(fā)生PJP的高危人群,這與上述的觀點(diǎn)[23,26]也是一致的。同時,值得注意的是,本研究中的PJP患者均有慢性腎功能不全的基礎(chǔ)病史,根據(jù)相關(guān)報道,慢性腎功能不全患者有獨(dú)特的病理生理機(jī)制,本就為感染易發(fā)人群[27-29]。綜合以上因素,本研究中的病例感染發(fā)生率較高,需對這一人群的相關(guān)感染性疾病給予關(guān)注。

而在臨床表現(xiàn)方面,PJP的臨床征象一方面是由于耶氏肺孢子菌可以直接附著于Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞,迅速地從小營養(yǎng)形式成長為較大的囊性形式,進(jìn)而導(dǎo)致彌漫性的肺損傷;另一方面是由于機(jī)體對外來病原體的防御機(jī)制使其自身處于炎癥狀態(tài),級聯(lián)的炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷,肺功能嚴(yán)重受限,最終造成機(jī)體的缺氧甚至呼吸衰竭[23,30]。

基于上述的流行病學(xué)及病理生理機(jī)制,CKD并發(fā)PJP的臨床進(jìn)展是十分迅速的,許多相關(guān)的臨床報道也證實(shí)了這一觀點(diǎn)[2,31-32]。本研究中,病例1患者24 h內(nèi)既從咳嗽、咳痰迅速進(jìn)展為呼吸衰竭狀態(tài),胸部CT所體現(xiàn)的炎癥征象也明顯進(jìn)展,后續(xù)加用卡泊芬凈及SMZ-TMP后,仍搶救無效死亡;而病例4、6、7在肺感染早期未發(fā)展為呼吸衰竭狀態(tài)即開始使用卡泊芬凈及SMZ-TMP治療,患者最終取得了良好的臨床結(jié)局;同時,病例5、8在呼吸衰竭早期(3 d內(nèi))開始使用卡泊芬凈及SMZ-TMP治療,最終病情也實(shí)現(xiàn)了好轉(zhuǎn)。所以,實(shí)現(xiàn)PJP的及時診斷以進(jìn)行針對性的治療十分重要。

在PJP診斷方面,依靠傳統(tǒng)微生物檢測方法進(jìn)行早期診斷尚存在一定限制,耶氏肺孢子菌無法在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng),無法通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)獲得直觀的病原體證據(jù)[23],而只能通過對標(biāo)本的組織學(xué)檢查實(shí)現(xiàn)PJP的病原學(xué)確診。但真菌在涂片中的載量較低,即便對標(biāo)本進(jìn)行涂片染色后,通常也無法在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)耶氏肺孢子菌特征性的囊腫或滋養(yǎng)層細(xì)胞[30]。在本報告的所有病例中,也均未通過傳統(tǒng)的微生物檢測方法取得耶氏肺孢子菌的陽性結(jié)果。在分子生物學(xué)水平,近年來PCR在耶氏肺孢子菌的檢測中也得到部分肯定;但是,PCR檢測需要特定的引物,耶氏肺孢子菌有許多種基因型,不同的基因型對應(yīng)不同的引物,這使得檢測的工作量及難度明顯增大[33-34]。此外,PJP的實(shí)驗(yàn)室檢查也僅有炎癥指標(biāo)升高、淋巴細(xì)胞計數(shù)降低及乳酸脫氫酶升高等非特異性結(jié)果,并不會對PJP的診斷起到?jīng)Q定性作用。此時,mNGS的出現(xiàn)有望克服以上的局限性,實(shí)現(xiàn)PJP的早期診斷。在一項臨床研究中,Zhang等[35]應(yīng)用mNGS對14名腎移植后患PJP的患者進(jìn)行病原體檢測,成功在13名患者中檢測出耶氏肺孢子菌,陽性率高達(dá)92.9%,而與此同時,傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)對耶氏肺孢子菌的檢出率為0,PCR的檢出率為78.6%(11/14),這一結(jié)果肯定了mNGS在PJP診斷中的重要價值。此外,mNGS檢測結(jié)果中病原體的序列數(shù)可能與患者的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān),此次報告中2例死亡患者的耶氏肺孢子菌序列數(shù)均>10 000,這一數(shù)值遠(yuǎn)大于預(yù)后較好的患者。因此,mNGS不僅可以實(shí)現(xiàn)PJP的早期診斷,還在一定程度上預(yù)測到病情的后續(xù)發(fā)展與結(jié)局。

此外,由于本研究患者均有CKD基礎(chǔ),抗生素使用需求較為迫切,且依據(jù)醫(yī)學(xué)倫理、遵照患者及家屬意愿,有7例在收取標(biāo)本進(jìn)行mNGS檢測之前即使用過針對耶氏肺孢子菌敏感的抗生素,但最終仍取得了mNGS的陽性結(jié)果。且根據(jù)Miao等[4]的研究,在已使用抗生素后才進(jìn)行病原體檢測的患者中,mNGS的陽性率高于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)。這表明臨床中可以在使用mNGS進(jìn)行病原體感染檢測的同時甚至之前即進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療,而這并不會影響最終的病原體檢測結(jié)果,依舊可以取得有力的病原學(xué)證據(jù),而傳統(tǒng)微生物檢測方法較難實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)。mNGS的這一項優(yōu)勢對于及時診斷并治療臨床進(jìn)展快速、病情兇險的PJP具有重大意義。

盡管mNGS在CKD并發(fā)PJP中有如此大的利用價值,但仍然有其局限性。最突出的在于,作為一種基于分子層面的檢測手段,mNGS不僅可以檢測病原體的核酸,還包括宿主、微生物群以及環(huán)境中引入的污染核酸在內(nèi)的所有核酸,雖然最終讀取結(jié)果是去除了低質(zhì)量序列、污染核酸序列、重復(fù)讀取序列等的高質(zhì)量序列,再過濾掉人類基因組序列后得到的病原體相關(guān)DNA序列,但仍然無法明確何為致病菌,何為定植菌。這導(dǎo)致了有很大數(shù)量的疑似背景微生物需要通過臨床醫(yī)生的解讀與鑒別,以確定其致病性,這就使得最終結(jié)果具有不可避免的主觀性[17,36]。因此,在臨床工作中,應(yīng)該通過關(guān)注mNGS檢測到的微生物序列數(shù)、患者臨床癥狀及體征、治療效果及預(yù)后等情況進(jìn)行綜合判定,以減少診斷誤差。

4 小結(jié)

PJP在非HIV患者中的發(fā)病率較高且仍在不斷增長,在不到2 a的時間里,團(tuán)隊就借助mNGS診斷出9例CKD患者并發(fā)的PJP,且其中6例經(jīng)過針對性抗感染治療取得臨床治愈。團(tuán)隊對mNGS在輔助診斷CKD并發(fā)PJP中的價值是給予肯定的,希望這一發(fā)現(xiàn)在未來通過不斷地診斷試驗(yàn)進(jìn)行有效驗(yàn)證。