遠端缺血預處理對急性缺血性腦卒中炎癥反應的作用及機制研究進展

朱蕓燕， 張傳武， 陳 靖， 曾名望， 楊 超， 張文福綜述， 梁偉東，2，3，4審校

據統計，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是僅次于冠心病的全球第二大死亡原因。IS是由腦血管閉塞引起的，占腦卒中病例的75%～80%［1］。組織型纖溶酶原激活劑等溶栓治療和短時間內的介入取栓術是最佳的治療策略，但其狹窄的治療窗口限制了其臨床應用［2］。錯過溶栓治療時間的患者僅有10%頸內動脈及25%大腦動脈部分再通的效果，嚴重威脅患者生命安全［3］。而在治療窗口期內接受治療的患者，腦血流復通后的缺血再灌注損傷（IRI）是造成缺血腦組織二次損傷的重要因素，嚴重影響著治療效果和患者預后。探究IRI 的防治措施及機制對治療缺血性相關中樞神經系統疾病具有重要意義。缺血預處理（ischemic preconditioning，IP）最早于1986年由Murry 等［4］提出，主要通過對靶器官進行反復、短暫、非致死性的缺血預適應訓練以激發機體內源性保護機制，產生并釋放腺苷、緩激肽、炎癥因子等內源性保護物質，誘導缺血耐受，從而提高靶器官對后續缺血缺氧的耐受能力。大量臨床及基礎研究證實，肢體遠端缺血預處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）同樣可誘導缺血耐受，提高遠端重要臟器（如大腦、心臟）對后續致死性缺血/缺氧損傷的耐受能力［5］。而且，RIPC 一般采用四肢充氣加壓袖短暫反復阻斷血流即可完成，具有無創、便捷、操作性強、廉價的優點。研究報道，RIPC 保護腦缺血損傷的機制包括調節神經炎癥/免疫調節、減輕血腦屏障損傷、抑制氧化應激及減少細胞凋亡等［6］。神經炎癥在缺血性腦卒中的病理生理過程中具有重要作用，RIPC 通過調節神經炎癥是其發揮保護作用中的重要機制。

1 AIS誘發的炎癥反應機制

炎癥反應在缺血性腦卒中的病理生理過程中發揮著重要作用。腦缺血打破促炎和抗炎反應之間的動態平衡，過度的炎癥反應加重對缺血腦組織的損傷［7］。炎癥因子及免疫細胞是缺血性腦卒中的關鍵因素，膠質細胞和外周免疫細胞均參與調節缺血性腦卒中的炎癥反應。

缺血性腦卒中發生后，表現為炎癥抑制信號減弱，而來自受損神經元釋放的如損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）的信號增強［8］。在IS 相關炎癥反應過程中，DAMPs 譜包括腺苷、熱休克蛋白、高遷移率基團盒1和白介素IL-33 等［9］。這些信號通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）進一步激活靜止的小膠質細胞、星形膠質細胞和周細胞，而被激活的腦免疫細胞上調促炎因子和趨化因子的表達，激活基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），破壞血腦屏障完整性，招募外周免疫細胞到損傷的腦組織區域，導致繼發性血腦屏障損傷。中樞神經系統中的小膠質細胞是最先對這些危險信號做出反應的細胞群之一［10］。在損傷后的幾分鐘內，小膠質細胞被激活，發生形態變化，并分泌細胞因子。作為大腦中數量最多的膠質細胞，星形膠質細胞通過招募外周免疫細胞，并通過分泌細胞因子和趨化因子與小膠質細胞相互作用，積極參與損傷后的免疫反應［2］。此外，星形膠質細胞也可能在急性期支持缺血神經元的存活。中樞神經系統血管內皮細胞的激活、血小板的失調，以及外周髓系細胞和淋巴細胞的侵襲，共同推動炎癥的進展，導致神經元細胞和血管內皮的損傷［11］。IS后，血腦屏障會在早期發生破壞，從而促進外周血白細胞向受損大腦的浸潤［10］。白細胞通過釋放促炎細胞因子、活性氧和MMPs，進一步加劇血腦屏障破壞［12］。在腦損傷的急性期，局灶性炎癥通過增強興奮性毒性、直接細胞溶解、氧化應激和血栓性炎癥加重腦損傷。這些事件進一步造成微血管功能障礙，腦水腫擴大，并最終惡化臨床結果［13］。相反，局灶性神經炎癥也可能參與碎片清除、神經營養因子產生和免疫調節，這些作用隨著時間的推移而明顯演變［14］。

2 炎癥反應在缺血性腦卒中的雙重作用

越來越多的證據表明，炎癥反應是一把“雙刃劍”，因為它不僅加劇了腦卒中急性期的繼發性腦損傷，而且有利于腦卒中后的大腦恢復［15］。臨床研究表明，全身炎癥可影響患者對腦卒中的易感性及治療的預后。然而，抑制炎癥反應可能會惡化缺血性腦卒中后的神經修復和遠期功能恢復。探明缺血性腦卒中不同階段激活的促炎通路與抗炎通路之間的動態平衡，對缺血性腦卒中的治療研究具有重要意義。

小膠質細胞是中樞神經系統（central nervous system，CNS）中主要的常駐免疫巨噬細胞，廣泛分布于大腦和脊髓，是神經血管單元的一個重要組成部分［16］。小膠質細胞在腦缺血時可迅速（在幾分鐘內）被激活，其激活和擴張在缺血性腦卒中后2～3 d達到峰值，并在初始損傷后持續數周。現已證實，在缺血性腦卒中病理生理過程中，激活的小膠質細胞具有雙重作用。在正常情況下，小膠質細胞作為中樞神經系統中的主要的免疫巨噬細胞，能夠在缺血、炎癥和神經變性的情況下發揮“清道夫”的作用，清除因缺血而損傷的組織、細胞和過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS) 、活性氮(reactive nitrogen species,RNS)等，使腦內微環境在一定時間內保持穩定和正常。此外，小膠質細胞的存在阻止了缺血時星形膠質細胞介導的炎癥因子的分泌。以維持炎癥動態平衡和大腦的正常功能。小膠質細胞還可產生各種神經營養因子，促進神經發生和可塑性［17］。然而，過度激活的小膠質細胞也會參與腦損傷的過程。例如，缺血性腦卒中后，應激但存活的腦細胞（主要是神經元）可能被小膠質細胞吞噬，加劇神經元的損失。這種過度吞噬也可導致遲發性腦萎縮和神經退行性改變。小膠質細胞激活轉化為吞噬細胞后，釋放多種具有細胞毒性的物質參與炎癥反應，增加血腦屏障通透性，導致腦水腫及組織壞死［18］。研究表明，小膠質細胞等雙重作用可能與被激活的時間有關，早期激活主要參與損傷過程，而晚期激活主要參與神經修復。此外，不同亞群的小膠質細胞在腦缺血中的作用不同，可增加或減少腦損傷［1］。

參與腦卒中炎癥反應的神經炎性因子主要包括白介素、干擾素、腫瘤壞死因子α、生長因子、細胞刺激因子等。這些炎性因子主要是由于外周的免疫細胞合成的，包括淋巴細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞等。當缺血發生時，浸潤的白細胞和小膠質細胞會使細胞因子升高，腦缺血后駐留的膠質細胞也會產生細胞因子。在腦缺血損傷時，促炎細胞因子和抗炎細胞因子的表達均上調，其上調的空間和時間上的差異主要取決于所使用的腦缺血類型［19］。3 種主要的促炎細胞因子是白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α（TNF-α），它們引發并加重卒中后的炎癥反應［20，21］。另外，轉化生長因子-β（TGF-β）和IL-10 是抗炎細胞因子，可抑制促炎細胞因子的表達，從而減輕缺血性卒中后的炎癥［22］。這些促炎因子和抗炎因子的動態平衡調節參與了腦卒中后的神經損傷和修復過程，其主要作用很大程度上取決于大腦損傷的程度和病理生理狀態［23］。

3 IPC與IS后炎癥反應

3.1 RIPC 概述 遠端缺血預處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）是指通過短暫、非致死性的遠端肢體缺血預適應刺激來誘導大腦的內源性保護機制，提高對后續缺血性事件的耐受能力，從而在后期腦缺血事件中減少神經細胞凋亡及壞死，減輕腦水腫，改善預后的一種干預措施［24］。早在1945 年就有科學家提出缺氧耐受的理論，認為在組織器官缺血、缺氧事件發生前后對機體進行一定的處理能夠調動細胞內外的應急系統，從而在缺血、缺氧性事件中為受損臟器提供一定的保護效應［25］。人們又將遠端缺血器官延伸到肢體上，從而大大減少了預處理的損傷程度，還可以通過無創袖帶加壓法阻斷血流等此類無創方式實施預處理，簡便易行。關于遠端肢體缺血預處理的可能機制，目前國際公認的有神經、體液、免疫相關途徑3 條主要途徑［5］。此外，尚有三者共同起作用的共同通路學說也在遠端肢體缺氧預處理的神經保護機制中占據一席之地，該學說認為：神經因素、體液因素以及免疫因素在遠端肢體缺血預處理對腦缺血的作用并非是單一的，而是相互影響，共同起作用的，當然也不排除有其他因素的參與［26］。

3.2 RIPC 作用于外周及中樞免疫系統 腦缺血發生初期，血腦屏障破壞，黏附因子/趨化因子表達增多，吸引多種免疫細胞在腦缺血損傷的不同階段浸潤病灶組織，致使梗死體積進一步擴大［27］。眾所周知，許多外周免疫細胞，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞（NK）、中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞，對于腦卒中的發生發展和轉歸都至關重要。免疫調節可能是RIPC 發揮腦保護效應的重要機制，RIPC 主要通過調控細胞免疫和體液免疫來減輕缺血再灌注損傷，其機制可能與改變免疫細胞亞群和循環中炎癥相關細胞因子的水平有關［28］。

3.2.1 淋巴細胞 淋巴細胞是一類主要的免疫細胞，主要通過細胞免疫參與神經炎癥和腦損傷。有研究報道，嚴重聯合免疫缺陷（SCID）小鼠或缺乏成熟B 和T 淋巴細胞的小鼠在短暫性腦缺血后表現出更小的腦梗死面積和更好的神經功能，說明淋巴細胞參與了腦卒中后的神經損傷作用［15］。另有研究報道，參與缺血性腦損傷的淋巴細胞主要為CD4+T細胞和CD8+T 細胞亞群［29］。缺血性腦卒中后，血腦屏障的破壞，為外周血T 淋巴細胞（主要為CD4+T 細胞和CD8+T 細胞）滲入到缺血大腦提供了通道。有研究證實，RIPC 可顯著降低腦卒中后血液中CD8+T細胞的數量，降低腦卒中后炎癥反應水平，產生腦保護作用［28］。RIPC 通過減少細胞毒性CD8+T 細胞浸潤到缺血性大腦進而參與腦保護作用。

B 淋巴細胞通過體液免疫參與腦卒中后神經炎癥反應，主要表現為神經保護作用。有研究報道，在小鼠大腦中動脈栓塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO） 中，B 淋巴細胞可通過分泌IL-10 等細胞因子產生神經保護作用。B 細胞缺陷會加重腦卒中后神經損傷，而當B 細胞過繼轉移到B 細胞缺陷小鼠中后可減少梗死面積，改善神經功能評分［30］。研究證實，MCAO 損傷可導致B 細胞種群減少，而RIPC 可促進MCAO 后B 細胞種群的增殖，提高B 細胞的占比，產生神經保護作用［31］。RIPC 引起的血液中B 細胞的上調可能是由于B 細胞生成的增加或從儲存處（如脾臟或骨髓）釋放增加，即使沒有中樞滲透，也可能通過分泌保護性炎癥因子對缺血腦組織產生保護作用。

3.2.2 外周單核/巨噬細胞 單核/巨噬細胞是循環中重要的抗原呈遞細胞，在T 細胞分化、吞噬和天然免疫中發揮重要作用。研究表明，在缺血性腦卒中后，單核/巨噬細胞主要分化成代表促炎（Ly-6Chi）和抗炎（Ly-6Clow）的兩種細胞亞群。隨著腦缺血后血腦屏障功能破壞，外周血單核/巨噬細胞很快滲入梗死區，并參與腦損傷和損傷后的修復。在小鼠中，促炎（Ly-6Chi）亞群表達G 蛋白連接膜蛋白CCR2受體。由炎癥組織產生的單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）特異性地將Ly-6Chi/CCR2+單核細胞亞群募集到損傷部位，并成為典型活化的M1 型巨噬細胞。相反，Ly-6Clow單核細胞亞群主要表達CX3CR1受體。這種抗炎的Ly-6Clow/CX3CR1+亞群被招募到正常組織中，分化成為常駐的M2 型巨噬細胞，在損傷后發揮宿主防御和修復的功能［32］。MCAO 小鼠模型血液中的非炎性單核細胞數量減少，而炎性單核細胞數量保持不變［33］。RIPC 可在腦卒中發生前增加循環中的非炎性單核/巨噬細胞水平，進而減輕腦缺血再灌注損傷［34］。可見，RIPC 的腦保護作用可能也與誘導抗炎的Ly-6Clow/ CX3CR1+單核/巨噬細胞亞群相關。

3.2.3 缺氧誘導因子 缺氧誘導因子（Hypoxia inducible factor， HIF）是一種敏感的氧穩態調節因子，在缺氧/缺血后被迅速誘導。它在腦卒中的病理生理中發揮著廣泛的作用，包括神經元存活、神經炎癥、血管生成、葡萄糖代謝和血腦屏障調節。HIF 被認為是炎癥的重要信號調節因子，它在腦內的時空表達隨著缺血性腦卒中的進展而發生變化。急性缺血性腦卒中發生后48 h，HIF-1α 和HIF-2α mRNA表達上調3倍以上，這一結果與梗死面積呈正相關［35］。RIPC 已被證明可以降低缺血性腦卒中HIF-1α 和HIF-2α 的表達，并降低血液和腦中的促炎細胞因子IL-1β和IFN-γ的蛋白水平。而使用HIF-1α抑制劑ACF 則消除了RIPC 對梗死和神經功能的保護作用。此外，ACF 還抑制了RIPC 誘導的促炎因子下調，包括血液中的IL-6 和IFN-γ 以及腦中的IL-1β和IFN-γ。ACF 還消除了大腦中Akt 信號通路的激活。綜上所述，HIF 在RIPC 的保護效應中發揮關鍵作用，其機制可能與調節Akt 信號通路介導的全身炎癥反應有關［36］。

3.2.4 細胞因子 細胞因子是一種能夠調節免疫和炎癥反應的關鍵介質，它們在細胞活化、分化和增殖過程中起著至關重要的作用，也是作為體液免疫中參與腦卒中后神經炎癥反應的重要組分之一［37］。TNF-α 是腦缺血損傷后炎癥反應中最早出現的細胞因子之一，參與缺血性腦卒中的炎癥反應過程。在缺血損傷的后1 d，腦組織中的TNF-α 水平可繼續升高，并與缺血損傷的嚴重程度相關，因此，TNF-α 可作為腦卒中發展過程或預后的生物標志物［38］。TNF-α 也是最早被確定為誘導缺血耐受所必需的細胞因子之一，它具有保護腦實質免受缺血再灌注損傷的作用［34］。通過脂多糖和CpG寡脫氧核苷酸等進行炎癥預處理刺激，可增加循環中的TNF-α，產生神經保護作用，而在TNF-α 缺陷小鼠中這些預處理刺激不能減輕神經缺血性損傷［39］。此外，TNF-α本身可作為一種預處理刺激來保護大腦免受缺血損傷。研究證實，RIPC 可提高MCAO 后小鼠血清中TNF-α 水平，產生腦保護作用［31］。因此，RIPC 后TNF-α 的誘導可能是遠端肢體預處理介導的保護作用的重要機制之一。

3.3 信號通路

3.3.1 NF-κB 信號通路 NF-κB 信號通路在炎癥性疾病以及包括重要炎性成分的疾病中發揮核心作用［40］。NF-κB信號通路可被缺血、缺氧、紫外線、輻射等傷害性刺激激活。有證據表明，NF-κB通過調控腦缺血靶基因的轉錄表達和其他腦缺血相關通路的活性，在腦缺血耐受的形成中發揮重要作用［41］。NF-κB 信號通路在缺血性腦卒中后的炎癥反應中同樣具有參與神經損傷和保護的雙重作用。其作用取決于通路激活的時間和參與激活的損傷因素的劇烈程度。研究表明，缺血預處理（IPC）可激活NF-κB 信號通路，增強NF-κB 蛋白在神經元中的DNA 結合活性，上調下游抗凋亡基因BCL-2 的表達，從而誘導缺血耐受抵抗后續致死性缺血缺氧損傷，NF-κB抑制劑PDTC可逆轉IPC的神經保護作用［42］。此外，RIPC通過激活NF-κB 信號通路產生的神經保護作用可被Notch1通路抑制劑DAPT減弱，這表明NF-κB通路是RIPC中Notch1信號通路的下游靶點。其機制可能與Notch1 與NF-κB 組分之間的互作轉錄調控和物理相互作用，以及Notch1與IKK 復合物組分的結合有關。而Notch1與NF-κB通路在RIPC介導的神經保護中相互作用的確切機制有待進一步研究。

3.3.2 Notch 信號通路 生物體內普遍存在的高度保守的Notch信號通路，與神經元分化、成熟、再生、功能形成以及神經系統退行性病變存在著非常密切的關系。Notch信號通路在腦卒中病理生理過程中也體現出損傷與抗損傷的雙重作用，這可能與Notch信號通路激活的方式和時間點及其在不同病理生理階段中動態變化的作用有關［43，44］。據報道，腦缺血和缺氧可以激活Notch1信號通路和四條顯著的相互作用通路（NF-κB、p53、HIF-1α 和Pin1），它們匯聚在一個保守的DNA 相關核多蛋白復合體上，控制著決定神經元命運基因的表達。當神經元經歷亞致死的缺血刺激（預適應）時，核多蛋白復合體上調了編碼促進神經元存活的蛋白質的適應性應激反應基因，但當缺血是致死刺激時，核多蛋白復合體誘導編碼觸發和執行神經元死亡程序的蛋白質的基因［45］。RIPC誘導腦缺血耐受機制也與Notch信號通路的激活有關。RIPC 通過Notch 信號通路間接調控AIS 后的神經炎癥反應。研究報道，在小鼠短暫性腦缺血模型中，RIPC 可通過激活Notch1 信號通路，進而抑制小膠質細胞活化，降低IL-1β、TNF-α 等細胞因子的表達，從而減輕腦缺血后的炎癥反應，減少神經元凋亡產生神經保護作用［43］。此外，RIPC還可以通過激活Notch信號通路誘導腦缺血后的血管新生。局灶性腦缺血大鼠模型實驗表明，與未處理的MCAO 大鼠相比，經過RIPC后的大鼠腦切片中血管生成率更高［34］。

4 小 結

急性缺血性腦卒中后過度的炎性反應是造成梗死后腦組織繼發性神經損傷的重要因素。遠端缺血預處理（RIPC）對炎癥反應的調控作用是其發揮神經保護作用的重要機制之一。RIPC 主要通過對細胞免疫和體液免疫及相關的細胞因子和信號通路的調控發揮作用。進一步全面闡明參與RIPC 誘導的神經保護的免疫細胞亞群功能及相關分子機制對AIS后炎癥反應的防治具有重要意義。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：朱蕓燕負責論文設計、撰寫；張傳武、陳靖負責文獻檢索、數據收集；曾名望、楊超負責論文文字潤色；張文福負責修訂格式；梁偉東負責指導選題、論文框架搭建并最后定稿。