DNA甲基化/去甲基化調控缺血性卒中的研究進展

李亞楠， 韓非原， 王 文， 伍昊文綜述， 孫宏巍審校

卒中是導致殘疾和認知缺陷的主要原因，占全球所有疾病死亡率的5.2%［1］，即使是卒中幸存者，大部分也需要依賴他人才能完成行走及其他日常活動。在中國，卒中是成人致殘致死的第一位病因［2］。《中國腦卒中防治報告2019》報告指出，在我國所有疾病人群中至少有1/5的死亡率來自于卒中，且卒中的發病率持續上升，特別是缺血性卒中［2］。缺血性卒中約占全部卒中的80%，具有高致殘率、高復發率和高死亡率的特點，極大程度影響患者的生活質量，給個人和國家帶來沉重負擔。

雖然缺血性卒中的發病機制仍模糊不清，但通常認為缺血性卒中與環境因素、遺傳因素及其交互作用有關，其中遺傳背景相關的風險約占37.9%［3］。盡管關于缺血性卒中的全基因組關聯研究發現了卒中風險相關的不同基因座，但這些遺傳變異僅能解釋缺血性卒中5%～10%的遺傳風險［4］，這代表著很多缺血性卒中相關的遺傳風險因素未被發現和重視，而表觀遺傳修飾就是其中之一。

1 表觀遺傳學與DNA甲基化/去甲基化

1.1 表觀遺傳學 染色質生物學是目前生物醫學和轉化研究中最令人興奮的領域之一。染色質是由DNA、組蛋白和相關因子構成的一個高度復雜且緊密盤繞的生物結構。所有超越基因組學的修飾都被稱為表觀遺傳修飾。表觀遺傳修飾是康拉德·沃丁頓在1942 年提出的一個術語，旨在彌合遺傳學、生長和分化之間的差距，可能是基因、環境和疾病之間的重要接口［5］。理論上來說，推動表觀遺傳改變的常見環境因素包括但不限于日常生活方式（如吸煙、飲酒）、重金屬（如鉛）的接觸和紫外線輻射等等。表觀遺傳調控可以在不改變DNA 序列的前提下進行遺傳和修飾［4］，其中一些是穩定的可以遺傳給后代的，另一些在環境因素的刺激下呈現出動態變化。表觀遺傳機制主要通過改變表觀遺傳密碼、調控相關基因表達來操縱各種生理和病理過程。有3 種主要的表觀遺傳密碼已經得到了很好的研究，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其中DNA 甲基化是最重要的表觀遺傳機制，已被深入研究［6］。

1.2 DNA 甲基化和去甲基化 Johnson 和Coghill在1925 年首次觀察到胞嘧啶殘基的甲基化，1975 年Holliday 和Pugh 提出胞嘧啶殘基的甲基化可以參與調控基因表達［7］。DNA 甲基化過程是在DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的調控下，從S-腺苷甲硫氨酸等供體中將甲基轉移到基因上的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosine phosphate-guanine，CpG）中的胞嘧啶殘基上，產生5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），使染色質結構更加緊密，轉錄機制無法接近，導致基因表達沉默。DNMT的3個核心成員（DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b），即維持酶和從頭酶［8］，在哺乳動物中均有表達。最早的DNMT1 被稱為“維持甲基轉移酶”，因為它可以使半甲基化的DNA 堿基對發生甲基化，而DNMT3a 和DNMT3b 屬于從頭甲基轉移酶，可使最初非甲基化的胞嘧啶發生甲基化。

近年研究者擴展了DNA 甲基化的經典觀點，認為CpG可能不是哺乳動物基因組中唯一的甲基化位點；此外DNA 主動去甲基化的證據也對這種表觀遺傳標記的穩定性提出了質疑。與DNA 甲基化相反，近期研究發現了DNA 去甲基化的機制，該機制通過10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白將5mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosin，5hmC）、5-甲酰胞嘧啶，逆轉5mC變為未修飾胞嘧啶，從而去除甲基化，導致轉錄激活和基因表達［9］。TET主要包括3 種亞型（TET1-3），均廣泛存在于大腦中［8］。除了通過TET 氧化5mC 脫甲基外，另提出了其他3種脫甲基化機制：（1）通過堿基切除修復將甲基化或氧化的堿基替換為非甲基化的胞嘧啶；（2）堿基切除修復后5mC 脫氨；（3）通過核苷酸切除修復去除5mC。

此外，DNA 甲基化還受到甲基-胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤結合域（methyl-CpG-binding domain，MBD）蛋白的調節。在MBD家族基因中，迄今為止已克隆出5個獨立的基因，即編碼甲基-CpG 結合蛋白2 和MBD1-4的基因［8］。MBD蛋白的重要作用之一是維持DNA 甲基化并與其直接作用，參與DNA 甲基化介導的基因表達抑制和/或異染色質形成。總之這些新進展證明了我們對DNA 甲基化呈現動態變化的更深理解。

2 DNA 甲基化/去甲基化調控缺血性卒中的研究進展

2.1 DNA 甲基化/去甲基化與卒中的發生近年來，DNA 甲基化在缺血性卒中發病機制中的作用得到重視［10，11］。各項基礎研究也致力于闡明DNA甲基化與卒中發生的機制。總體來說，在缺血性卒中動物模型中，DNA甲基化的整體水平升高，并且與大腦中DNMT 的較高活性相關。Hu 等［12］發現，血栓反應蛋白1 是一種血管生成抑制因子，參與調節血小板的聚集和腦梗死的發生，在體外缺血模型中血栓反應蛋白1 基因的啟動子區發生了高度甲基化。另外，血栓調節蛋白是一種表達于內皮細胞表面的膜蛋白，有抗凝血特性，對腦缺血具有保護作用。血栓調節蛋白啟動子區的DNA 超甲基化與同型半胱氨酸水平升高、內皮損傷和卒中風險增加相關［13］。

臨床研究發現高水平的血漿同型半胱氨酸是缺血性卒中的獨立危險因素，胱硫醚β 合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）是同型半胱氨酸代謝過程的主要酶。Wang 等［14］描述了CBS 啟動子區的DNA 高甲基化與人群卒中風險增加相關。CBS 啟動子區的高甲基化可能導致酶活性降低、血漿同型半胱氨酸升高和卒中易感性增加。此外，血脂異常也是缺血性卒中的危險因素，載脂蛋白E 是一種參與脂質代謝的血漿脂蛋白，研究發現載脂蛋白E 基因啟動子區的甲基化狀態會影響腦梗死的發生風險［15］。利鈉肽系統被認為是缺血性卒中的重要調節因子，研究證實4個利鈉肽系統基因的DNA 甲基化下調與缺血性卒中發生相關［16］。

動脈粥樣硬化是缺血性卒中的重要病因。有趣的是研究發現小鼠模型的頸動脈血流受到干擾時，DNMT 活性會增加，而抑制DNMT 會降低動脈粥樣硬化病變的風險［17］。內皮功能障礙是動脈粥樣硬化發展的早期特征，幾項體外研究強調了DNA 甲基化在內皮功能障礙中的關鍵作用［18］。此外，研究表明血管細胞黏附蛋白1 的高表達可以促進動脈粥樣硬化的發生，LINE基因的低甲基化會誘導血管細胞黏附蛋白1 表達增加，從而促進動脈粥樣硬化發生，增加缺血性卒中的發病風險［19］。也有研究發現，在發生動脈粥樣硬化的血管中，與血管生成和炎癥相關的基因的甲基化CpG 島的水平明顯下降，這些變化導致叉頭盒蛋白P1（forkhead box protein P1，FOXP1）的下調、晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGE）受體配體的上調以及 NOTCH1 和表皮生長因子樣結構域 7（epidermal growth factor-like domain 7，EGFL7）的激活而它們是已知的參與調節動脈粥樣硬化形成的重要因子［17］。

2.2 DNA甲基化/去甲基化與卒中的治療 小鼠大腦中動脈閉塞后，大腦整體DNA 甲基化水平上升，這與DNMT活性增加有關，應用DNMT 抑制劑減輕了卒中的嚴重程度，延遲了缺血性腦損傷。Nandan 等［20］發現DNMT 抑制劑治療通過上調金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitors metalloproteinases-2，TIMP-2）的表達來預防腦梗死后發生的線粒體功能障礙而發揮神經保護作用。Endres 等研究發現在大腦中動脈閉塞模型中，野生型（DNMT+/+）小鼠的DNA 甲基化水平顯著增加，而轉基因DNMT S/+小鼠則沒有顯示任何變化。大腦中動脈閉塞后的梗死體積和活細胞數的分析表明DNMT S/+小鼠的梗死體積減小和活細胞數增加。此外，在大腦中動脈閉塞的野生型（DNMT +/+）小鼠中，用5-氮雜-脫氧胞苷（5-aza-dC，一種DNMT 抑制劑）治療后觀察到病變體積減小［21］。另一種DNMT 抑制劑zebularine 在小鼠缺血性腦損傷實驗中也被證實可以減輕腦水腫和血腦屏障的通透性，改善神經功能缺損［22］。近年研究發現小檗堿可以下調DNMT1 和DNMT3a 的表達，降低DNA 甲基化水平，對缺血再灌注損傷呈現保護作用［23］。

新證據表明TET 和5hmC 可以發揮神經保護作用。TET1保護神經元免受活性氧和caspase-3依賴的神經毒性，而TET1基因敲除動物的神經元對氧化損傷更敏感［24］。此外，TET2和5hmC耗竭會降低成年小鼠的神經元存活率，導致海馬神經元生長受損和認知功能下降，而重建TET2即可減輕老年大腦的認知功能障礙［24］。同時，TET3在DNA損傷修復通路中發揮重要作用，可以觸發損傷后的軸突再生，從而促進學習和記憶過程中的突觸可塑性［24］。最近的研究已經確定抗壞血酸（維生素C）是一種表觀遺傳調節劑，它通過激活TET 酶參與DNA 中5hmC 的生成。卒中后應用抗壞血酸治療可提高TET3活性和5hmC水平，減少梗死面積，促進運動和認知功能恢復［25］。

2.3 DNA甲基化/去甲基化與卒中的預后 DNA甲基化可能在卒中預后中發揮重要作用，尤其對中樞神經系統中多種細胞的命運至關重要。基礎研究發現同型半胱氨酸對缺血性卒中神經發生的負面影響可能與DNA 甲基化有關。經同型半胱氨酸處理的缺血腦組織中，DNMT 的活性降低，DNA 呈現低甲基化，神經干細胞的自我更新能力受到抑制，這說明通過降低同型半胱氨酸水平來維持正常的DNA 甲基化，可能促進卒中后神經恢復和重建［26］。多項研究調查了DNMT 在突觸可塑性機制中的重要性，DNMT 缺陷小鼠表現出記憶障礙和海馬區突觸可塑性降低［27］。血小板分泌的血小板反應蛋白1 是腦缺血期間誘導血管生成和神經修復所必需的炎癥介質，在卒中后恢復過程中DNA 甲基化誘導血小板反應蛋白1 基因沉默會抑制神經恢復，加劇卒中損傷［8］。

而在臨床研究中，基因甲基化與卒中預后的關系一直是研究熱門。Natalia 等［28］發現EXOC4基因（主要參與調控胞吐作用、細胞生長胞質分裂和神經元發育等）的DNA 甲基化上調與卒中后較差的功能結局相關。一項研究對700 名卒中患者的表觀基因組關聯分析數據進行初步研究，分析了基因組中450 000 個CpG 島，發現了一些CpG 位點的缺失，會通過調控轉化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號通路相關蛋白的表達、抑制細胞增殖等方式導致了卒中的不良預后［29］；而另一項研究測定了以DNA 甲基化為標志的生物年齡與卒中患者的不良預后密切相關［30］。最新一項研究發現NPPB基因啟動子的高甲基化與卒中患者住院14 d或出院時的良好功能結局相關［31］。以上研究均提示DNA甲基化與缺血性卒中預后密切相關。

2.4 DNA甲基化/去甲基化與卒中的康復 卒中會導致長期神經功能缺損，因此卒中后的康復治療成為卒中患者的治療重點。卒中后任務導向訓練對運動功能恢復的作用眾所周知，但這種效果在一段時間內是有限的。因此，同時進行DNA 甲基化調控和任務導向訓練，可以克服慢性期恢復的局限性。當DNMT 抑制劑5-aza-dC 與任務導向訓練一起使用時，卒中后運動功能受損程度顯著改善［32］。

生長抑制和DNA 損傷誘導因子 45β（growth arrest and DNA damage inducible protein 45 β，Gadd45β），一種活性DNA 去甲基化調節因子，介導的去甲基化可能調節神經的發生以響應外部的損傷信號［33］。Gadd45b 缺失的小鼠海馬中神經祖細胞增殖和新生神經元的樹突生長均存在缺陷，可能與神經發生相關基因啟動子區無法發生DNA 去甲基化，從而引起成纖維細胞生長因子1 和腦源性神經營養因子的表達下降有關［34］。

MBD1對成人神經發生的研究表明，MBD1敲除小鼠的神經干細胞發育減少和基因突變增加［35］。海馬齒狀回在成年MBD1敲除小鼠中表現出神經發生減少和空間學習受損［8］。總體而言，這些結果表明DNA 甲基化和去甲基化精確地協調了神經的發生，對健康的神經祖細胞和大腦活動至關重要。然而，動態DNA 甲基化在神經發生中的作用的理解仍處于初級階段，還需深入研究。

2.5 DNA甲基化/去甲基化與卒中的復發 DNA甲基化/去甲基化與缺血性卒中后血管事件的復發相關。多項研究旨在發現氯吡格雷治療的缺血性卒中患者血管復發相關的差異甲基化位點。Li等［36］發現GANQ基因的低甲基化與氯吡格雷治療的急性缺血性卒中患者缺血事件的高復發風險相關。另有研究報道ABCB1啟動子區的低甲基化與CYP2C19*1/*1基因型的中國缺血性卒中患者對氯吡格雷的不良反應相關［37］。一項表觀基因組研究表明，在接受氯吡格雷治療的缺血性卒中患者中，TRAF3基因中cg03548645位點的低甲基化與血小板聚集增加和血管事件復發相關［38］。同一團隊的另一項研究發現［39］，在接受阿司匹林治療的患者中，PPM1A基因中cg04985020 位點的高甲基化與血管事件復發相關。Soriano 等［40］發現生物年齡（與年齡相關的DNA甲基化變化）是卒中復發的獨立危險因素，卒中復發患者的生物學年齡明顯高于無卒中復發的患者。

3 DNA 甲基化/去甲基化研究面臨的挑戰與對策

缺血性卒中患者的DNA 甲基化/去甲基化分析需要測試疾病的關鍵組織，但在實際研究中很難得到人類的腦組織樣本或人類的血管樣本。因此血液樣本仍然是進行心腦血管疾病DNA 甲基化分析的良好選擇。因為血液樣本很容易獲取，檢測的侵入性很小，而且缺血性卒中的癥狀雖然以腦功能受損為特征，但根本上是血管病變引起大腦血液供應中斷所致，而與腦組織本身病變無甚相關。Liu 等［41］指出，卒中受試者血液中的ACTB基因甲基化水平較低，這表明血液可用于識別與卒中相關的DNA 甲基化分子的變化。

DNA 甲基化/去甲基化在卒中的應用是一個新興研究領域，它似乎在缺血性卒中不同階段中起著重要作用，與卒中發生、治療、復發和功能結局密切相關。DNA 甲基化/去甲基化可以將卒中的環境刺激轉化為可逆的基因異常表達。但由于缺血性卒中病因的復雜性，目前研究還處于初級階段，未來需要更多的研究，更大的樣本量，更深入的國際合作探索缺血性卒中的DNA 甲基化/去甲基化變化和下游相關基因的表達，為研發調控DNA甲基化/去甲基化藥物的臨床轉化提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李亞楠負責文獻收集、撰寫文章、論文修改；韓非原、王文、伍昊文負責文獻收集；孫宏巍負責擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。