N6-甲基腺苷修飾在呼吸系統疾病中的研究進展

韓永康,杜毓鋒,錢 力,李 丹,孫梓越,劉學軍

(1.山西醫科大學,山西 太原 030012;2.山西醫科大學第一醫院老年病科,山西 太原 030001)

隨著空氣污染、吸煙及老齡化等因素的影響,慢性呼吸系統疾病已成為我國居民的主要死因,同時對家庭、社會產生沉重的經濟負擔,各級醫療機構需要對其重點防治[1]。近年來,越來越多的證據表明表觀遺傳因素在呼吸系統疾病發展中發揮重要作用,RNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾方式之一,其中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修飾在真核生物中廣泛存在。m6A修飾水平失調可導致多種肺部疾病的發生,與其調節因子(甲基化轉移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白)的異常減少或增加密切相關。m6A 修飾為肺部疾病發生、發展提供新的分子機制,給疾病的治療提供新策略、新方法。

1 m6A修飾

m6A修飾是 RNA腺嘌呤堿基上的第6位氮原子發生甲基化,在真核生物表觀遺傳修飾中廣泛存在,還可調控非編碼RNA代謝[2]。m6A 的生物學過程主要依靠調控因子的參與,通過動態調控基因轉錄后表達水平維持細胞生物學功能。m6A修飾數量和分布特征可通過抗體免疫共沉淀技術、高通量測序及m6A敏感性RNA核糖核酸酶的測序技術等獲得[3]。

m6A甲基轉移酶常以復合物形式發揮生物學作用,甲基轉移酶樣蛋白3(Methyltransferase-like protein,METTL3)通過與S-腺苷甲硫氨酸結合獲得甲基轉移酶活性,作為甲基轉移酶活性的核心成分介導細胞核中的RNA甲基化。而甲基轉移酶樣蛋白14(Methyltransferase-like protein 3,METTL14)間接參與催化甲基轉移,可與METTL3以1∶1的比例形成穩定的異二聚體,維持復合物完整性以及與底物RNA結合,單獨的METTL3具有較弱的催化活性,只有與METTL14結合后才會增強METTL3的催化作用[4]。也有研究發現METTL3-METTL14復合物對體外DNA損傷區域有一定的修復作用[5]。Wilms腫瘤抑制1相關蛋白(Wilms tumor 1-associating protein,WTAP)與METTL3-METTL14復合物相互作用,促進復合物定位于核散斑,激活甲基轉移酶的催化活性以及與靶標RNA結合。同時還有多種調控因子與催化復合物結合,目前已知的Vir樣m6A相關甲基轉移酶、RNA結合基序蛋白(RNA binding motif proteinl5 14,RBM15)及其同源蛋白RBM15B、METTL16、具有CCCH結構鋅指蛋白13等,它們主要負責RNA特定位點的甲基化[6]。去甲基化酶可對已發生 m6A 修飾的堿基進行去甲基化修飾,揭示了m6A修飾是動態可逆的。目前發現兩種去甲基化酶,肥胖相關蛋白(Fat mess and obesity us sociated,FTO)和烷基化蛋白 AlkB 同源物5(AlkB homolog 5,ALKBH5),二者均屬于二價鐵/α-酮戊二酸鹽依賴的AlkB雙加氧酶家族。研究發現ALKBH5在癌癥中起著致癌或抗癌的雙重作用[7],需要進一步深入研究表觀遺傳學調控規律。甲基化閱讀蛋白可識別發生 m6A-RNA 甲基化的堿基并激活下游的調控通路,調節甲基化RNA剪接、核輸出、降解、翻譯等過程[8]。

2 m6A修飾與呼吸系統疾病

近年來有研究表明,m6A修飾與呼吸系統疾病的發生發展密切相關,如肺纖維化、哮喘、肺癌、慢性阻塞性肺疾病等。RNA m6A 修飾與呼吸系統疾病的發生發展密切相關,可能給呼吸系統疾病的發生提供新的分子機制,給疾病的治療提供新策略、新方法[9]。

2.1 m6A修飾與肺纖維化 肺纖維化是一種不可逆轉的慢性致命性肺部疾病,表現為炎癥損傷后組織修復異常,肌成纖維細胞過度增殖和活化,可引起肺部結構損傷、功能障礙,最終導致器官衰竭。肺纖維化發病機制復雜,目前藥物治療對肺纖維化只能起緩解作用,不能從根本上逆轉或治愈該疾病,因此,早期診斷和尋找肺纖維化的潛在藥物治療靶點尤為重要[10]。國外研究表明m6A 甲基化修飾可能為肺纖維化的診斷和治療帶來新的希望,根據HUANG等[11]的研究,發現富含亮氨酸的PPR基序蛋白和FTO可評估疾病預后和提供治療靶點,m6A調控因子可預測肺纖維化的患病率。成纖維細胞轉換的肌成纖維細胞 (Fibroblast to myofibroblast transition,FMT)是肺纖維化中主要的膠原蛋白生成細胞[12],是引起肺纖維化的最重要的病因。因此,避免肌成纖維細胞的過度增殖和活化,維持其穩態是防控肺纖維化的重點。相關研究發現m6A 修飾可直接參與肺纖維化相關通路,從而實現調控FMT過程。如ZHANG等[13]發現,在博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠模型和肺纖維化患者肺部樣本中,可通過沉默METTL3來降低RNA m6A修飾水平,從而抑制FMT增殖和活化。另外,根據DENG等[14]研究成果表明,在博萊霉素誘導小鼠肺纖維化模型和人肺纖維化樣本中METTL3存在異常表達,METTL3可被視為診斷肺纖維化發生的重要生物標志物以及藥物治療的靶標。總之m6A 修飾與肺纖維化的形成密切相關,針對m6A調控因子藥物的研發可能為肺纖維化的治療提供新的策略。

另外,隨著空氣污染及吸煙等因素的影響,肺纖維化的發生率逐年升高,急性粉塵顆粒可導致體細胞基因組RNA甲基化改變[15]。有研究表明長期吸入各種含量過高的游離粉塵顆粒(炭黑、PM2.5或二氧化硅)沉積于肺組織可影響m6A 修飾水平,導致肺部出現不可逆性纖維化,其中以成纖維細胞過度增殖和細胞外基質在肺組織內沉積過多為特征[16],致肺功能出現不可逆性的下降,最終使患者的呼吸功能喪失。如經碳黑處理后的大鼠肺組織中Pri-miRNA-126的m6A修飾水平下調,引起下游靶向調控基因PI3K介導的PI3K/AKT/mTOR通路激活,導致肺組織發生纖維化[17]。PM2.5暴露通過降低ALKBH5水平,使靶向Yes相關蛋白1(Yes-associated Protein 1,YAP1)-mRNA 的 miRNAs水平下降,激活調節肺部炎癥的YAP1信號通路,促進細胞外基質沉積最終導致肺纖維化[18]。

二氧化硅誘導的肺纖維化同樣受m6A修飾的影響,如WANG等[19]研究說明,METTL3可促進肺成纖維細胞的活化、遷移,并通過circRNA m6A修飾參與二氧化硅誘導的肺纖維化。ZHANG等[20]發現,ALKBH5、FTO表達水平下調而METTL3表達上調,在二氧化硅誘導肺纖維化形成中發揮了重要作用。然而,根據SUN等[21]研究,在二氧化硅誘導的肺纖維化小鼠組織中ALKBH5表達增加,其對轉化生長因子TGF-β1刺激成纖維細胞活化過程中起促進作用,抑制ALKBH5表達可在體外發揮抗纖維化作用,其機制是ALKBH5通過miR-320a-3P/FOXM1軸或直接靶向調控FOXM1促進二氧化硅誘導的肺纖維化。ALKBH5低表達抗纖維化或致纖維化的矛盾結果,一方面表明表觀遺傳學在肺纖維化中的重要作用,另一方面也顯示了轉錄后基因表達調控的復雜性。考慮其矛盾結果與RNA m6A修飾檢測尚無公認的參考方法,樣本數量較少、評價結果的標準不一,不同實驗室研究結果缺乏可比性等因素相關,此后還需要開展大規模的隨機對照試驗,找到其關鍵的調控分子及其作用靶點。

2.2 m6A修飾與慢性阻塞性肺疾病 慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見的以持續存在的呼吸系統癥狀和氣流受限為特征的肺部疾病,病程較長且起病緩慢,主要癥狀為咳嗽、咳痰、活動后氣短,嚴重影響患者生活質量。我國COPD患者數量龐大,吸煙是COPD發生的重要因素[22]。有研究發現香煙煙霧可誘導 METTL3 過表達,并在支氣管上皮細胞中產生大量成熟的 microRNA-93(miR-93),miR-93激活氨基末端激酶(JNK)通路,上調誘導彈性蛋白降解的基質金屬蛋白酶9和基質金屬蛋白酶12的水平,從而導致肺氣腫[23]。相關調節蛋白異常表達,與肺部血管損傷和肺功能下降密切相關,可誘發COPD急性加重[24]。細顆粒物(PM2.5)暴露也是COPD發生發展的重要原因,PM2.5使m6A調節因子METTL16表達上調,調節硫酸酯酶2的表達,誘導血管內皮細胞凋亡、增加血管通透性、減少血管生成,導致肺微血管損傷,從而促進COPD的發生發展,同時也為COPD的治療提供了新的靶點[25]。肺泡巨噬細胞極化在COPD發展過程中發揮重要作用[26],有研究報道,COPD患者體內FTO表達較低,而過表達FTO可調節 PM2.5刺激后肺泡巨噬細胞的極化和相關信號通路活性,因此FTO可能在COPD發展中發揮重要作用[27]。HUANG等[28]研究發現,m6A修飾與COPD的發生高度相關,其調控因子METTL3、FTO等可協同發揮作用,影響COPD進展關鍵基因的表達而促進COPD的進展,但具體的作用機制仍需進一步研究。綜上所述,m6A調控因子與COPD發生發展密切相關,該因子為COPD的治療提供了新的靶點,應對其機制進行深入研究,以期實現基礎研究與臨床之間的轉化。

2.3 m6A修飾與哮喘 哮喘是嚴重危害人類健康的慢性呼吸道疾病。因其反復發作,嚴重影響患者生活質量。目前有研究表明RNA甲基化修飾與哮喘發生發展密切相關[29]。DAI等[30]研究成果表明,m6A調節因子在兒童哮喘的發生中起著不可忽視的作用,利用m6A調節因子可預測兒童哮喘發作的風險,針對m6A修飾的研究可能為兒童哮喘的治療提供有效的策略。FAN等[31]研究發現,哮喘患者外周血CD3 T細胞中有較高的METTL4表達,提高了m6A修飾水平。有研究發現[32],人氣道上皮中FTO缺失可導致FOXJ1 mRNA不穩定,使纖毛細胞數量明顯減少,敲除FTO的小鼠在過敏原刺激時可有強烈的哮喘樣表型。在嚴重哮喘中m6A調控因子同樣發揮關鍵作用,對重度哮喘有重要意義的嗜酸性粒細胞受到m6A調節因子的影響,該機制可能為未來的哮喘治療提供新見解[33]。哮喘是一種慢性炎癥性疾病,涉及復雜的基因作用。SUN等[34]研究,驗證了哮喘患者中三個m6A修飾的關鍵基因(BCL11A,MATK和CD300A),發現它們主要分布在外顯子中,富集在3’ UTR中,對m6A修飾的基因進行干預可能為哮喘的治療提供新思路。LIN等[35]發現,m6A、m1A、APA和A-to-I修飾是最有效的RNA修飾,在嚴重哮喘的發生中起重要作用。另外MO等[36]。發現DNA甲基化和m6A修飾之間同樣存在相互作用,并且發現白藜蘆醇可能靶向調控失調的m6A基因,可以作為哮喘的潛在治療劑。總之,m6A 修飾在哮喘發生發展過程中發揮了重要作用,不同修飾方式之間的相互作用也有重要的研究意義,為哮喘患者治療帶來新策略、新方法。

2.4 m6A修飾與肺癌 全球肺癌新發病例達到210萬,死亡病例達到180萬,肺癌的發病率、病死率在所有腫瘤中排在首位,提高肺癌的診療水平顯得尤為重要[37]。在肺癌發生發展過程中,上皮-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是癌細胞獲得侵襲力的關鍵。SUPHAKHONG等[38]研究表明,METTL3高表達可調控EMT進程,從而促進肺癌的發生和轉移。也有研究發現ALKBH5表達下調、METTL3表達上調可促進肺癌發生發展,通過提升ALKBH5和敲除METTL3表達來降低m6A水平,從而抑制癌細胞中3D球體的生成和小鼠肺內腫瘤的形成[39]。然而,另有研究報道ALKBH5高表達可促進非小細胞肺癌進展,敲低其表達可抑制體內腫瘤生長,ALKBH5可降低TIMP3 mRNA的穩定性從而抑制其表達,ALKBH5/TIMP3通路可促進肺癌細胞增殖同時抑制其凋亡[40]。探索過程中有些研究結論相互沖突,ALKBH5高表達可抗癌或致癌及抗纖維化或致纖維化的不同結論,矛盾的結果說明表觀遺傳學在肺癌及肺纖維化過程中發揮著重要作用。肺纖維化患者患肺癌的風險很高,抗纖維化治療可減緩疾病進展,并可能延長生存期,但RNA m6A 修飾具體的調控機制需要進一步研究[41]。

目前判斷肺癌預后多集中于臨床特征,如腫瘤的TNM分期、分化程度以及胸膜是否受累等。由于大部分肺癌患者就診時已處于晚期,所以尋求早期診斷肺癌的生物學標志物、盡早進行治療顯得尤為重要。m6A修飾為開發高精度、低成本、侵入性小的新型生物標志物及大規模癌癥篩查提供了新的方向和策略。ZHANG等[42]通過研究血清樣本發現,m6A-miRNAs標記在包括肺癌的多種癌癥類型中表現出優異的靈敏度,且其診斷性能不受性別、年齡等因素的干擾。近年來,相關研究發現m6A調節因子與肺癌患者預后顯著相關。LIU等[41]研究發現,METTL3與非小細胞肺癌患者預后顯著相關,可作為患者的預后指標。綜上所述,以m6A甲基化為代表的表觀遺傳學修飾,在肺癌的發生發展、診斷、治療及預后中發揮著重要作用。

3 總結與展望

慢性呼吸系統疾病(纖維化、COPD、哮喘、肺癌等),給我國帶來了沉重的醫療負擔。針對m6A 修飾在慢性呼吸系統疾病的深入研究,加深了對表觀遺傳學調控規律的認識,同時對疾病發病機制、診斷、新藥作用靶點及判斷預后提供了重要的理論依據。盡管肺部疾病相關研究已有進展,但關于m6A修飾還有許多關鍵問題需要解決。一方面,m6A修飾檢測尚無公認的參考方法,其調控因子并未被完全鑒定出來,并且目前研究結果仍存在爭議,具體功能和調控機制仍需要繼續深入探索,以期增強表觀遺傳學調控規律的理解。m6A修飾在肺部疾病的病理過程中機制復雜,找到其關鍵的調控分子及其調控靶點是重點也是難點。另外,調節因子及基因為靶點的藥物研發成果相對缺乏,此后還需要開展大規模、高質量的基礎和臨床研究,制定出合理且科學的評價體系,實現基礎研究到臨床應用之間的轉化,為患者的診治帶來新策略、新方法。