宏基因二代測序在脊柱感染診治中的應用進展

龍思萍 劉志禮 黃山虎 劉家明

1南昌大學第一附屬醫院骨科（南昌 330006）；2南昌大學第四臨床醫學院（南昌 330100）；3南昌大學脊柱脊髓研究所（南昌 330006）

脊柱感染（spinal infection，SI）是由特定病原微生物感染脊柱所致疾病的統稱，主要累及椎體、椎間盤及椎體周圍軟組織，包括椎體骨髓炎、椎間盤炎、硬膜外膿腫等［1-2］。脊柱感染占全身所有肌肉骨骼感染的2%～7%，是一種比較少見的感染性疾病，其臨床表現、實驗室檢查、影像學檢查缺乏特異性［3-4］。獲得病原微生物是診斷脊柱感染的唯一依據，傳統檢測方法包括常規微生物培養和組織病理學檢查，但這些方法存在陽性率低、靈敏度低、耗時長等缺點，不利于脊柱感染的快速精確診斷［5］。

宏基因二代測序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）作為一種新興的病原微生物檢測手段，是相對于一代DNA 測序技術而言的新型測序方法，具有快速、準確率高、病原微生物覆蓋廣等特點［6-7］。近年來，mNGS 應用于脊柱感染的研究已有不少報道，本文就mNGS 在脊柱感染診治中的應用進展進行綜述，分析mNGS 在脊柱感染不同病原體中的檢測效能，根據mNGS 指導脊柱感染臨床用藥情況，以及目前mNGS 所存在的不足，為mNGS 應用于脊柱感染提供參考。

1 mNGS 概述

mNGS 是結合新一代測序技術建立的宏基因組學研究方法，通過高通量測序和數據分析研究樣本中微生物的組成，能無偏倚地檢測各種病原體，包括細菌、真菌、病毒及寄生蟲等［8］。與傳統檢測方法相比，mNGS 不僅能檢測出常見的病原微生物，對于罕見或潛在的病原體，mNGS 具有一定的優勢［9］。目前，mNGS 已應用于多種感染性疾病的病原學診斷，包括呼吸系統感染［10］、中樞神經系統感染［11］、血液感染［12］和骨關節感染［13］等。近年來，越來越多的研究表明，mNGS 在脊柱感染的病原學診斷中表現出良好的檢測效能，其有效性對該疾病的治療具有指導意義。

2 mNGS 的原理和檢測流程

mNGS 通過獲取樣本中所有核酸片段的序列信息，與數據庫中的序列進行分析與比對，檢測出所有微生物的種類及豐度，實現直接對臨床標本進行無假設、不依賴于培養的病原體檢測［4，14］。其檢測流程分為三個部分：樣本的采集，實驗室檢測和生物信息學分析。mNGS 的樣本來源廣泛，包括組織、體液及環境樣本等；實驗室檢查包括核酸的提取、文庫的制備和測序過程；待測序完成后，對測序數據進行質控，將去除人類核酸序列的數據與病原體數據庫進行比對，最后形成具體的報告［15］。

3 mNGS 在脊柱感染中的應用

3.1 mNGS 在脊柱感染不同病原體中的檢測效能

3.1.1 細菌細菌是引起脊柱感染最常見的病原體，常見的病原菌包括金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌、大腸桿菌、布魯氏菌及鏈球菌等［16］。細菌培養是檢測病原菌的“金標準”，但該方法存在陽性率低、培養周期長、受抗生素藥物影響等缺點，且部分病原菌生長條件苛刻，難以培養，導致細菌培養的檢出率不高［17-18］。mNGS 彌補了上述方法的不足，在脊柱感染診斷中表現出良好的檢測效能。劉飛等［18］研究共納入54 例化膿性脊柱炎患者，mNGS 檢測的總體陽性率達90.7%，明顯高于常規微生物培養的59.2%，在采用常規微生物培養無法檢測出病原體的病例中，很多可以通過mNGS檢測出來，檢測病原體的比率高達77.3%。這一結果表明，相比于常規微生物培養，mNGS 在檢測細菌方面具有明顯優勢。除檢出率高外，XU 等［19］研究發現mNGS 檢測細菌的靈敏度顯著高于常規微生物試驗（90.30%vs.53.40%）。石仕元等［5］研究得出的mNGS 與傳統細菌培養陽性菌譜中，前三位病原菌均為以葡萄球菌為代表的球菌屬、大腸埃希菌及鏈球菌屬，說明mNGS 同樣對常見病原微生物有較高的準確檢出率。此外，mNGS 不易受使用抗生素藥物的影響。HUANG 等［16］研究表明，抗生素藥物的使用顯著降低了培養法的檢出率（66.0%vs.45.5%，P=0.021），而對mNGS 的檢出率沒有顯著影響（82.5%vs.77.3%，P=0.467）。WANG等［20］研究亦得到相似結果。由此可見，在診斷脊柱細菌感染方面，mNGS優于傳統檢測方法。

3.1.2 真菌脊柱真菌感染在臨床上較為罕見，約占各類脊柱感染的0.5%～1.6%，常見的真菌包括曲霉菌和念珠菌［21］。長期使用糖皮質激素或免疫抑制劑、靜脈注射藥物成癮、長期留置中心靜脈導管、腸外營養等是導致脊柱真菌感染的危險因素［22］。因其癥狀、體征及實驗室檢查與其他類型的脊柱感染差別不明顯，影像學表現也缺乏特異性，因此臨床診斷相對困難［23］。真菌培養是診斷脊柱真菌感染的一種有效手段，然而傳統的血液和組織培養靈敏度低，特別是在鑒別不同菌屬感染時，需要較長的培養時間［24］。隨著分子生物技術的發展，mNGS 逐漸應用于脊柱真菌感染的臨床診斷。XU 等［19］研究發現，在真菌診斷方面，mNGS 的靈敏度高于常規微生物培養（100.00%vs.25.00%）。張冬梅等［4］的研究共納入40 例脊柱感染患者，通過mNGS 檢測有4 例為真菌感染，而組織培養無真菌檢出情況。劉春等［25］研究納入的57 例脊柱感染患者中，通過mNGS 檢測出8 例為真菌感染（14.0%），而常規微生物培養僅檢測出1 例，從微生物標本送檢至結果報告，mNGS 檢測周期為24～36 h，相比于常規微生物培養（3～7 d），檢測周期明顯縮短。由此可見，mNGS 在脊柱真菌感染的快速精確診斷方面具有明顯優勢。

3.1.3 結核結核分枝桿菌被認為是世界上主要的傳染病殺手，脊柱結核約占所有結核病的1%～3%，約占肌肉骨骼感染的50%［26-27］。目前用于診斷脊柱結核的方法主要有微生物培養、X-pert 和T-SPOT.TB。WANG 等［28］研究表明，mNGS 診斷脊柱結核的靈敏度顯著高于微生物培養（80.0%vs.11.1%）。ZHANG 等［29］通過送檢27 份脊柱結核樣品發現，mNGS 檢測和X-pert 檢測對結核分枝桿菌的檢出率差異無統計學意義（P＞0.05），但都高于培養組（P＜0.001）。上述結果表明，相比于微生物培養，mNGS 在診斷脊柱結核方面具有顯著優勢。雖然X-pert 對結核分枝桿菌具有良好的檢測能力，但不能檢測到到其他細菌，僅適用于脊柱結核的診斷［30］。LI 等［14］研究指出，在脊柱結核患者中，T-SPOT.TB 和mNGS 的靈敏度無顯著差異（94.7%vs.89.2%），但T-SPOT.TB 的特異性明顯低于mNGS（78.3%vs.100.0%），因此T-SPOT.TB 的檢測結果不能作為診斷脊柱結核的主要依據，提示mNGS在診斷脊柱結核方面優于T-SPOT.TB。

除檢出率高和靈敏度高之外，mNGS 的優勢還在于區分結核和非結核性感染。近年來，疑似脊柱結核患者中非結核性感染的比例逐漸增加，盡管非結核性脊柱感染和脊柱結核具有相似的臨床癥狀和影像學表現，但它們的治療方式是不同的，對疑似脊柱感染患者的誤診或延誤治療會造成嚴重后果［14，31］。因此，快速精確診斷這兩種疾病是治療的關鍵。LI 等［14］研究發現，在非結核性脊柱感染患者中，mNGS 的靈敏度明顯高于細菌培養和病理學檢查（84.9%vs.15.4%，26.2%）；在脊柱結核患者中，mNGS 的靈敏度明顯高于MGIT 960 培養和病理學檢查（94.7%vs.45.9%，67.9%）。這一結果表明，mNGS 在診斷脊柱結核和非結核性脊柱感染方面優于傳統檢測方法。然而，由于結核分枝桿菌細胞壁較厚，破壁存在困難，影響核酸提取效率，因此，未來需提高破壁處理技術，進一步研究mNGS 在脊柱結核方面的應用。

3.1.4 其他病原體除上述病原體外，一些罕見或潛在的病原體也可能引發脊柱感染。PCR 等分子生物學檢測方法提高了微生物的檢出率，但僅適用于已知病原體，對未知病原體并不合適［32］。據報道，mNGS 理論上可以檢測樣品中所有已知和未知的病原體，并已用于非典型病原體感染的診斷［33-34］。HUANG 等［16］研究發現，除引起脊柱感染常見的微生物外，mNGS 還檢測到其他罕見或潛在的微生物，如鮑曼不動桿菌、人型支原體和煙曲霉。WANG 等［28］研究檢測到一些機會致病菌（如奇異變形菌和中間鏈球菌）以及一些難以培養的致病菌（如痤瘡丙酸桿菌），表明mNGS 在鑒定罕見的機會致病菌和難以培養的致病菌方面具有一定優勢。石仕元等［5］發現，除結核、非結核分枝桿菌外確診11 例特異性感染患者，常規細菌培養陽性2 例，mNGS 測序真陽性11 例，表明mNGS 對少見病原微生物具有較高的檢出率。劉春等［25］研究發現，在無法培養的病毒感染病例中，mNGS 檢測陽性率達到了21.1%（12/57）。由此可見，與傳統方法相比，mNGS 對非典型病原體具有更廣的檢測范圍，在診斷罕見或潛在的病原體感染中具有獨特優勢。

3.2 根據mNGS 指導脊柱感染臨床用藥在脊柱感染的臨床診療中，判斷病原體的類型從而針對性地使用抗生素一直是脊柱感染治療的重點和難點［35］。獲得病原微生物是確診感染的唯一依據。由于傳統檢測方法存在陽性率低、靈敏度低、耗時長等缺點，使臨床上經驗性用藥時間顯著增加，既增加了患者住院時間，又增加了致病微生物耐藥的風險［36］。mNGS 對病原體檢出率高、靈敏度高且周期短，越來越多的研究表明，mNGS 在指導脊柱感染臨床用藥方面凸顯出極大的優勢。臨床醫生可根據mNGS 檢測結果判斷病原體的類型，從而針對性地使用抗生素，或及時對抗生素方案作出有效的調整，以獲得快速、良好的臨床療效。郭超峰等［37］納入82 例脊柱感染患者，基于mNGS的針對用藥組患者術后C 反應蛋白（CPR）和紅細胞沉降率（ESR）呈下降趨勢，術后30 d，針對用藥組的ESR 較經驗用藥組明顯下降（P=0.044），提示與經驗用藥相比，根據mNGS 檢測結果針對性地使用抗生素的患者預后更好。ZHANG 等［29］亦得到相似結果，且針對用藥組患者CRP、ESR 恢復正常所需時間明顯短于經驗用藥組（P＜0.05），這一結果表明，根據mNGS 結果針對性地使用抗生素可使脊柱感染患者獲得更好、更快的療效。WANG 等［20］發現，在根據mNGS 結果修改抗生素方案的患者中，治療成功率為83.33%，顯著高于未參考mNGS結果而使用抗生素的患者（56.52%），表明mNGS 在改善醫療決策和優化抗生素治療方面發揮重要作用。然而，mNGS 易受背景菌的干擾，臨床醫生應結合患者臨床癥狀、實驗室檢查結果及影像學表現作出綜合診斷。未來還需要更多的研究證明mNGS 在指導脊柱感染臨床用藥中的優勢，為臨床醫生制定更好的治療方案提供參考。

4 mNGS 的局限性

mNGS 能無偏倚地檢測各種病原體，檢出率高且周期短，彌補了傳統檢測方法的不足，在脊柱感染的診治中表現出良好的應用前景。然而，mNGS仍存在以下不足：（1）mNGS 成本較高，限制了檢測的樣本量，并增加患者的經濟負擔；（2）mNGS易受污染物、人源細胞及背景菌等干擾，難以確定mNGS 檢測出的病原體是否為致病病原體；（3）尚未完全建立耐藥基因庫，對病原微生物的評價作用有限；（4）檢測報告的解讀尚無統一標準［16，29，38］。對此，未來需要優化mNGS 的檢測流程，其實更加自動化、標準化，降低mNGS 的檢測成本；實驗室人員應嚴格遵守檢測流程，設置陰性對照，避免外源核酸的干擾導致假陽性結果的出現；同時完善擴大耐藥基因庫，并結合傳統檢測方法作出綜合判斷；在對測序數據進行生物信息學分析時，需邀請專業的生物信息團隊，并建立統一的結果判讀標準，

5 總結與展望

mNGS 作為一種新興的病原微生物檢測手段，對不同病原體脊柱感染的診斷具有顯著優勢。相比于傳統檢測方法，mNGS 具有檢出率高、靈敏度高、周期短、不易受抗生素藥物影響等優點，且病原微生物覆蓋廣，對常見微生物及罕見或潛在的微生物具有良好的檢測效能，在指導脊柱感染臨床用藥方面發揮重要作用。然而，mNGS 存在一定的局限性，并不能完全取代傳統檢測方法，因此在診斷脊柱感染時，需將二者結合以提高診斷效能，并依此制定有效的臨床治療方案。

隨著測序技術的發展，越來越多的臨床實驗室已開展mNGS 檢測。由于脊柱感染是一種少見的感染性疾病，加上mNGS 成本較高導致樣本量有限，使實驗結果存在一定的偏倚。未來需要更大樣本量、更長隨訪時間的隨機對照研究進一步探索mNGS 在脊柱感染診治中的應用價值，為脊柱感染的早期精準治療提供病原學依據。

【Author contributions】LIU Jiaming suggested the topic of this article.LONG Siping conceived the outline of the manuscript by searching the literature，wrote the major parts of the manuscript.LIU Zhili，HUANG Shanhu and LIU Jiaming reviewed and edited the manuscript.All authors have read and approved the final manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.