硫酸鹽還原菌的生長因子分析及脫硫性能研究

周天然，狄軍貞

（遼寧工程技術大學土木工程學院，遼寧阜新 123000）

酸性礦山廢水（Acid mine drainage，AMD）pH低、含有高濃度的硫酸鹽，如隨意排放會導致其中污染物通過食物鏈攝入到人體，危害人類健康，如何對其進行有效處理是目前采礦業面臨的難題之一〔1-2〕。以硫酸鹽還原菌（Sulfate-reducing bacteria，SRB）處理技術為代表的微生物法作為一類非常具有潛力的含硫酸鹽污水處理技術，具有高效、環保和低能耗等優點〔3〕。SRB 在自然環境中普遍存在，其能在厭氧或缺氧條件下利用有機物還原SO42-，產生硫化物，用以沉淀重金屬，同時產生堿物質以提高pH〔4-6〕，因此SRB 可用于處理廢水中SO42-的污染，目前也已有眾多研究對利用SRB 的代謝處理廢水中SO42-和重金屬的技術進行了報道〔7-10〕。研究表明，影響SRB 代謝的因素較多，如溫度、環境pH、S2-濃度和m（COD）/m（SO42-）等〔11-15〕。適宜SRB 生長的條件能提高SRB 的代謝活性，從而提高SRB 對含SO42-廢水的處理效果。但目前對SRB 生長影響因素及脫硫性能的研究較少。基于此，本研究采用批量實驗，綜合分析溫度、環境pH、S2-質量濃度和m（COD）/m（SO42-）這4 個影響因素對SRB 生長的影響，并探究SRB 在不同環境下的脫硫性能，為SRB 修復含SO42-廢水的應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 SRB 的培養

富集SRB 的種泥取自遼寧省某尾礦周邊濕潤的土壤。將5 g 種泥加入到120 mL 無菌Starkey 培養基〔3〕中，置于厭氧條件下于35 ℃、150 r/min 轉速的培養箱中振蕩培養。其中，Starkey 培養基配方：0.5 g Na2SO4，1.0 g NH4Cl，0.5 g K2HPO4，0.1 g CaCl2·2H2O，2.0 g MgSO4·7H2O，1.2 g （NH4）2Fe（SO4）2·6H2O，0.1 g 抗壞血酸，4.0 mL 乳酸鈉，1.0 g 酵母膏，1 L 蒸餾水，pH=7.0，121 ℃滅菌30 min。當液體變成黑色且有H2S 氣味，說明培養液中已經富集出SRB。通過將5 mL 含有SRB的培養液接種到120 mL 無菌Starkey 培養基中進行連續培養實現細菌的大量增殖，得到含有大量SRB 的菌液，備用。

1.2 SRB 生長曲線的測定方法

將5 mL SRB 菌液接種到120 mL 無菌Starkey 培養基中，置于35 ℃、150 r/min 轉速的培養箱中振蕩培養，以無菌培養基作為空白對照組。每隔一段時間取適量菌液測定其OD600。實驗共做3 組重復，取均值繪制SRB 生長曲線。

1.3 SRB 生長因子探究

采用批量實驗探究溫度、S2-濃度、環境pH、m（COD）/m（SO42-）對SRB 生長代謝的影響。

1.3.1 溫度的影響

按V（SRB 菌液）∶V（培養基）=1∶24 將處于對數生長期的SRB 接種到一系列pH=7 的Starkey 培養基〔m（COD）/m（SO42-）=2〕中，并分別放置于不同溫度（29、32、35、38、41 ℃）的培養箱中以150 r/min 轉速振蕩培養8 d。培養完畢，取適量液體，測定OD600、氧化還原電位（ORP）、pH、電導率（EC）、SO42-質量濃度，探究溫度對SRB 生長代謝的影響。

1.3.2 S2-濃度的影響

將不同質量的Na2S 添加到Starkey 培養基后制備S2-質量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/L 的含S2-培養基，再按V（SRB 菌液）∶V（培養基）=1∶24 接種處于對數生長期的SRB，在35 ℃、150 r/min 轉速條件下培養8 d，探究S2-濃度對SRB 生長代謝的影響。

1.3.3 pH 的影響

調節無菌Starkey 培養基初始pH 分別為4、5、6、7、8，按V（SRB 菌液）∶V（培養基）=1∶24 接種處于對數生長期的SRB，通過檢測35 ℃不同初始pH 條件下SRB 生長8 d 后溶液的OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率，探究pH 對SRB 生長代謝的影響。

1.3.4m（COD）/m（SO42-）的影響

調節Starkey 培養基中乳酸鈉和Na2SO4的添加量，使Starkey 培養基中m（COD）/m（SO42-）分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，按V（SRB 菌液）∶V（培養基）=1∶24 接種處于對數生長期的SRB，在溫度為35 ℃，pH=7 條件下培養8 d，探究m（COD）/m（SO42-）對SRB生長代謝的影響。

1.4 分析方法

依據《水質 硫酸鹽的測定 鉻酸鋇分光光度法》（HJ/T 342—2007）測定SO42-質量濃度，依據《水質pH 值的測定 電極法》（HJ 1147—2020）測定溶液pH，采用筆式ORP 計測定氧化還原電位，采用筆式EC 計測定電導率。

2 結果與討論

2.1 SRB 的生長曲線

實驗測定的SRB 生長曲線見圖1。

圖1 SRB 的生長曲線Fig.1 Growth curve of SRB

由圖1 可知，在培養時間為14～86 h 時，SRB 的數量顯著增加，處于對數期，SRB 活性高、代謝旺盛。在培養時間為86～146 h 時，SRB 生長處于穩定期，細菌總數大，但是分裂增殖速度降低。由生長曲線可知，處于對數生長期的SRB 細菌增殖快、數量多、活性高、代謝旺盛，因此處于對數生長期的SRB 適合用于探究不同影響因素對SRB 生長的影響，分析SRB 在不同環境下的脫硫性能。

2.2 溫度對SRB 生長的影響

富集SRB 的土壤性質以及采樣點的環境會對SRB 的生長產生一定的影響，導致不同土壤富集的SRB 最佳生長溫度不同。本研究就溫度對實驗SRB菌種生長的影響進行了研究，結果見圖2。

圖2 溫度對SRB 生長的影響Fig.2 Effect of temperature on the growth of SRB

圖2（a）為各溫度條件下菌液的OD600及pH。OD600能間接體現培養液體系中的SRB 數量，由圖2（a）可知，當溫度為29、32、35、38、41 ℃時，培養完畢菌液OD600分別為0.99、1.29、1.33、0.51、0.39，表明SRB在29～41 ℃溫度下均能存活，但在32、35 ℃培養時，菌液OD600較大，SRB 增殖較快，特別是溫度為35 ℃時SRB 增殖最明顯，說明該溫度條件最適宜SRB 的生長繁殖。胡浩鳴〔16〕分離的SRB 菌株N19D-S 最佳生長溫度為35 ℃，張琳琳〔17〕分離的SRB 菌株A3-21ZLL 最佳生長溫度為35 ℃，與本研究結果一致。此外，29、32、35、38、41 ℃下培養后菌液pH 分別為8.42、8.55、8.78、8.09、7.64，當溫度為35 ℃時pH 增加最為明顯。pH 的增加主要歸因于SRB 能夠正常代謝SO42-、氧化有機物，該過程會生成HCO3-，有效提升菌液pH〔18〕。35 ℃下pH 提升最大，間接驗證了35 ℃時SRB 的生長增殖活動最佳，代謝產堿度最大，而菌液呈弱堿性又促進了SRB 的增殖〔19〕。

圖2（b）所示為溫度對菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影響。由圖2（b）可知，29、32、35、38、41 ℃下ORP 分別為-297、-371、-393、-128、-102 mV，35 ℃時，ORP 出現顯著下降的現象。有報道稱，在ORP＜-100 mV、5＜pH＜9 的含SO42-環境條件下，SRB 成為厭氧細菌中的優勢菌種〔20〕。本研究中，與未接種SRB 的Starkey 培養基相比，SRB 在29～41 ℃培養時，溶液的ORP 均降低且均＜-100 mV，說明SRB 在此溫度范圍內活性均較好。此外，溶液的EC 穩定在2.75～2.90 mS/cm，說明不同培養溫度條件下SRB 生長消耗培養液中的鹽質量接近。由圖2（b）還可知，29、32、35、38、41 ℃下SRB對SO42-的去除率分別為60.70%、85.60%、84.77%、46.41%、29.56%。35 ℃時，SO42-去除率最高；41 ℃時，SO42-去除率最小。通常細菌內部酶的活性受溫度影響，從而影響SRB 處理SO42-的效率，因此SRB 的活性可以通過SO42-的去除率間接反映。通過比較SO42-的去除率可知，在32、35 ℃條件下SRB代謝比較旺盛，41 ℃下SRB 代謝比較慢，這是因為，當環境溫度由29 ℃逐漸升高時，SRB 中的酶活性逐漸升高，增強了SRB 對SO42-的代謝活性，有助于對SO42-的去除；但當溫度超過38 ℃時，構成SRB 菌的蛋白質結構的分子熱能增加，引起部分氫鍵、范德華力等非共價鍵的斷裂，導致SRB 菌整體活力下降〔21〕。因此，當培養溫度為41 ℃時，SRB 對SO42-的去除率降低至29.56%。

綜上所述，當培養環境溫度為35 ℃時，SRB 的活力最強。

2.3 S2-質量濃度對SRB 生長的影響

S2-質量濃度對SRB 生長的影響見圖3。

圖3（a）為不同S2-濃度下菌液的OD600及pH。由圖3（a）可知，當培養基中S2-的初始質量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/L 時，接種SRB 培養8 d 后，OD600分別為0.30、0.23、0.25、0.16、0.14，OD600均較小且數值接近，表明大多數SRB 菌已經喪失了活力。另外，其整體呈現隨S2-濃度增加OD600減小的趨勢。有研究表明，當環境中的溶解態硫化物達到一定濃度時，SRB 的生長和代謝會受到一定抑制〔22-23〕。這可能是因為，S2-具有一定毒性，其含量的持續升高會使SRB 數量急劇下降〔24〕。當培養基中S2-的初始質量濃度為20、40、60、80、100 mg/L 時，pH 分別為7.71、7.68、7.55、7.41、7.26。與初始pH=7 相比，培養SRB 后溶液的pH 有所增加，但是增加幅度較小。特別是在初始S2-質量濃度為100 mg/L 時pH 增加最小。初始S2-質量濃度在20、40、60 mg/L 時，溶液中pH 的增加主要與SRB 代謝有關，在初始S2-濃度很小時，SRB 可以通過代謝生成堿性物質，但是代謝產物S2-的積累不僅會對SRB 代謝造成阻礙，還有可能會導致SRB 死亡。死亡后的SRB 會將胞內物質重新釋放進入溶液并使體系pH 呈略微下降趨勢。

圖3（b）所示為S2-濃度對菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影響。當培養基中S2-的初始質量濃度為20、40、60、80、100 mg/L 時，溶液的ORP 分別為-179、-143、-109、-23、-13 mV。此時，在S2-初始質量濃度為80、100 mg/L的條件下，溶液的ORP均＞-100 mV，體系中SRB 幾乎死亡，表明S2-濃度越高，SRB 菌體的死亡越嚴重。當培養基中S2-的初始質量濃度為20、40、60、80、100 mg/L 時，溶液的EC 分別為2.69、2.84、2.89、3.25、3.53 mS/cm，SRB 對SO42-的去除率分別為58.11%、49.74%、41.77%、21.59%、14.48%。當S2-濃度較低時，SRB 有活性，能夠代謝SO42-；當S2-濃度較高時，SRB 代謝受S2-濃度抑制，甚至大量死亡，SO42-的去除速率顯著降低。

綜上所述，體系中S2-的含量越高，SRB 的活力越弱，過高濃度的S2-最終會引起SRB 菌體死亡。

2.4 初始pH 對SRB 生長的影響

H+濃度會對SRB 體內酶產生一定影響，從而使得SRB 菌體活動受到不同初始pH 水平的影響〔25-26〕。基于此，本研究考察了初始pH 對SRB 生長的影響，結果見圖4。

圖4 初始pH 對SRB 生長的影響Fig.4 Effect of initial pH on SRB growth

圖4（a）所示為各初始pH 條件下菌液的OD600及pH 變化。由圖4（a）可知，當初始pH 分別為4、5、6、7、8 時，OD600分別為0.41、0.72、0.99、1.33、1.45，即隨著環境pH 的增加，OD600逐漸增加。當初始pH 為4時，OD600較低，pH 為7 和8 時，OD600顯著增加，說明酸性條件會抑制SRB 的生長，而中性和弱堿性條件利于SRB 生長。由圖4（a）還可以看出，培養后，溶液的pH 分別為7.01、7.33、7.89、8.78、9.48，均較初始pH 有所增加，這可能是由于SRB 在代謝硫酸鹽的過程中氧化有機碳產生了HCO3-〔26〕。

圖4（b）所示為初始pH 對菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影響。當初始pH 分別為4、5、6、7、8 時，溶液的ORP 分別為-176、-199、-309、-393、-418 mV，SRB 對SO42-的去除率分別為37.71%、55.74%、71.59%、84.77%、88.78%。在環境pH 為7 和8 的條件下，ORP 顯著降低，表明中性和弱堿性環境對SRB的生長是有利的，此時SRB 的生長和其對硫酸鹽的還原效果達到最佳，而酸性條件會抑制SRB 的代謝活動〔27〕。這是因為，溶液中的H+可以改變SRB 細胞的膜面電荷，進而對其吸附性能產生一定影響，此外，pH 也會對SRB 微生物體內的酶活力及穩定性產生一定的影響，進而對SO42-的代謝過程產生一定的影響。綜上所述，SRB 對周圍環境pH 的耐受范圍為5～8，在pH 為7～8 的條件下，SRB 的活力最強。

2.5 m（COD）/m（SO42-）對SRB 生長的影響

m（COD）/m（SO42-）對SRB 生長的影響見圖5。

圖5 m（COD）/m（SO42-）對SRB 生長的影響Fig.5 Effect of m（COD）/m（SO42-） on SRB growth

圖5（a）所示為不同m（COD）/m（SO42-）條件下菌液的OD600及pH 變化。由圖5（a）可知，當培養基初始m（COD）/m（SO42-）分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 時，對應的OD600分別為0.89、1.12、1.33、0.97、0.91，即隨著m（COD）/m（SO42-）的增加，OD600先增加后降低，當m（COD）/m（SO42-）=2 時OD600達最高，也就是SRB 的數目最高。研究表明，理論上0.67 g 的COD 可還原1 g 的SO42-〔27〕，然而，由于實際培養過程中SRB 和產甲烷細菌之間對基質的競爭，實際需要的m（COD）/m（SO42-）要遠遠高于理論m（COD）/m（SO42-）〔28〕。有研究表明，當m（COD）/m（SO42-）為1.7～2.7時SRB 和產甲烷細菌競爭最激烈，且在此范圍內m（COD）/m（SO42-）較低時SRB 占主導地位〔15〕。當培養基中的初始m（COD）/m（SO42-）分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 時，pH分別為8.71、8.75、8.78、8.71、8.44，這表明，在培養基初始m（COD）/m（SO42-）=2 時，既可以促進SRB 的生長，又可以產生堿性物質。

圖5（b）所示為初始m（COD）/m（SO42-）對菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影響。當培養基中的初始m（COD）/m（SO42-）分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 時，接種SRB 培養8 d 后，ORP 分別降至-303、-358、-393、-346、-316 mV。研究表明，SRB 在代謝SO42-過程中，通過產生代謝物H2S、HS-和S2-等降低了溶液的ORP〔29〕。當培養基中的初始m（COD）/m（SO42-）分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 時，EC 分別為2.85、2.70、2.90、2.96、2.89 mS/cm，SRB 對SO42-的去除率分別為68.41%、77.56%、84.77%、75.70%、73.03%。SO42-在初始m（COD）/m（SO42-）=2.0 時的去除率最高，表明SRB 這個時候的代謝最旺盛。

綜上所述，SRB生長的最佳m（COD）/m（SO42-）為2。

綜合各影響因素對SRB 生長的影響，得到SRB 最佳生長條件為溫度35 ℃、pH=7、m（COD）/m（SO42-）=2，此條件下采用Starkey 培養基培養處于對數期的SRB 8 d 后，溶液OD600、pH、ORP、EC 和SO42-去除率分別為1.33、8.78、-393 mV、2.90 mS/cm 和84.77%。

3 結論

SRB 適合用于處理含SO42-廢水，但是處理SO42-效果受溫度、環境pH、S2-質量濃度、m（COD）/m（SO42-）等因素限制。本研究采用批量實驗，綜合分析溫度、環境pH、S2-質量濃度和m（COD）/m（SO42-）4 個影響因子對SRB 生長的影響，探究SRB 在不同環境下的脫硫性能，得到如下結論：

1）培養14～86 h 時，SRB 處于對數期，此時細菌的活性最高。此階段的SRB 接種成活率高，適合接種到新環境中分析SRB 在不同環境下的脫硫性能。

2）通過將對數生長期的SRB按V（SRB菌液）∶V（培養基）=1∶24 接種到Starkey 培養基中，結合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指標，考察溫度對SRB 生長的影響，發現在35 ℃時，SRB的活力達到了最大值，即SRB的最佳培養溫度是35 ℃。

3）通過將對數生長期的SRB 接種到含不同質量濃度S2-的培養基中，結合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指標，考察S2-質量濃度對SRB 生長的影響，發現隨著培養體系中S2-質量濃度的不斷增加，不但會對SRB 活性產生一定的影響，還會使SRB細胞凋亡。

4）通過將對數生長期的SRB 接種到不同pH 的Starkey 培養基中，結合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指標，考察環境pH 對SRB 生長的影響，發現SRB 耐受的環境pH 為5～8，其中環境pH 為7～8 時SRB 的活力達到最佳。

5）通過將對數生長期的SRB接種到含不同m（COD）/m（SO42-）的培養基中，結合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指標，考察m（COD）/m（SO42-）對SRB生長的影響，發現SRB生長的最佳m（COD）/m（SO42-）為2。

6）在SRB 生長最佳條件，即溫度35 ℃、pH=7、m（COD）/m（SO42-）=2 條件下，采用Starkey 培養基培養處于對數期的SRB 8 d后，溶液OD600、pH、ORP、EC 和SO42-去除率分別為1.33、8.78、-393 mV、2.90 mS/cm 和84.77%。