植物乳桿菌發(fā)酵提取未成熟琯溪蜜柚果實(shí)果膠工藝優(yōu)化

丁紅霞 楊遠(yuǎn)帆,2,3 黃淑安 倪 輝,2,3

柚類水果是中國南方廣泛種植的水果之一。其中,琯溪蜜柚是福建省平和縣種植量最大的水果之一。自2015年以來,琯溪蜜柚年產(chǎn)量超過120萬t,年出口量超過14萬t[1]。在柚類水果種植過程中會(huì)有大量未成熟柚類果實(shí)(immature pomelo fruit,IPF)產(chǎn)生,約占柚類水果總生產(chǎn)量的20%～50%[2]。這些殘次果不僅造成巨大的資源浪費(fèi),還會(huì)污染環(huán)境。有研究表明,IPF中含有較高的精油[3]和果膠[4]。其中,果膠是一種存在于植物組織中的復(fù)合雜多糖,因具有獨(dú)特的凝膠特性被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域,這可能是未成熟柚類果實(shí)潛在的有效利用途徑。

目前,工業(yè)上主要采用酸堿法進(jìn)行果膠提取,但酸堿溶液易腐蝕提取設(shè)備,并對(duì)環(huán)境產(chǎn)生不利影響[5]。研究表明,酵母菌[6]、乳酸菌[7]、曲霉[8]等微生物同樣可以用于植物果膠提取。發(fā)酵法提取果膠是利用微生物代謝產(chǎn)生的酶和酸類物質(zhì)破壞植物細(xì)胞壁,從而釋放出果膠類物質(zhì)[9],具有反應(yīng)條件溫和、耗能低、環(huán)境污染低等優(yōu)點(diǎn)[10]。從目前來看,有關(guān)微生物發(fā)酵法提取果膠的研究尚未應(yīng)用至柚類水果的未成熟果實(shí)中。乳酸菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)[11],酸性物質(zhì)可將植物中非可溶性果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠,從而促進(jìn)果膠的溶出[12],同時(shí),乳酸菌在發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生果膠酶,也可有效促進(jìn)植物組織中的果膠提取[13-14]。此外,植物乳桿菌等乳酸菌發(fā)酵提取的果膠多糖具有較好的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)[15]。

研究擬以果膠提取率為指標(biāo),對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵未成熟琯溪蜜柚果實(shí)提取果膠的工藝參數(shù)(接種量、發(fā)酵時(shí)間及液料比)進(jìn)行優(yōu)化,并分析植物乳桿菌發(fā)酵提取果膠的性質(zhì),旨在為利用未成熟柚類果實(shí)生產(chǎn)果膠提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未成熟琯溪蜜柚果實(shí):未成熟琯溪蜜柚果實(shí)切片后于60 ℃烘干、粉碎,過60目篩備用,福建省平和縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站;

乳酸菌菌粉:含有1×1010CFU/g的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),山東中科嘉億生物工程有限公司;

MRS肉湯:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;

濃硫酸、無水乙醇:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

咔唑:分析純,上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平:ME104E/02型,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

酶標(biāo)儀:Epoch 2 T型,美國伯騰公司;

生化培養(yǎng)箱:ZWYR-2102型,上海智城分析儀器制造有限公司;

雙人單面超凈工作臺(tái):SW-CJ-2FD型,蘇州凈化設(shè)備有限公司;

立式壓力蒸汽滅菌器:YXQ-LS-30SH型,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果膠提取工藝 精確稱取一定量的原料與蒸餾水混合后裝入三角瓶中,用16層紗布及牛皮紙封口,121 ℃滅菌15 min。將植物乳桿菌粉于MRS肉湯培養(yǎng)液中37 ℃活化,制得植物乳桿菌懸浮菌液,按照一定的接種量(以體積量計(jì))接種到滅菌的原料中,混勻,37 ℃靜置發(fā)酵一定時(shí)間。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

(1) 接種量:固定發(fā)酵時(shí)間24 h,液料比20∶1 (mL/g),分別選取接種量為8%,10%,12%,14%,16%(以體積量計(jì))進(jìn)行試驗(yàn),確定最佳接種量。

(2) 發(fā)酵時(shí)間:固定接種量12%,液料比20∶1 (mL/g),分別選取發(fā)酵時(shí)間為12,24,36,48,60 h進(jìn)行試驗(yàn),確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

(3) 液料比:固定接種量12%,發(fā)酵時(shí)間24 h,分別選取液料比為10∶1,15∶1,20∶1,25∶1,30∶1 (mL/g)進(jìn)行試驗(yàn),確定最佳液料比。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以果膠提取率為考察指標(biāo),對(duì)接種量、發(fā)酵時(shí)間和液料比進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn),采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化IPF果膠提取工藝參數(shù)。

1.3.4 果膠提取率測(cè)定 采用硫酸咔唑比色法[16]。以吸光度為縱坐標(biāo),半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.006 4x+0.005 9,R2=0.996 9,并按式(1)計(jì)算果膠提取率。

(1)

式中:

Y——果膠提取率,%;

c——標(biāo)準(zhǔn)曲線上的半乳糖醛酸質(zhì)量濃度,μg/mL;

m1——烘干的果膠質(zhì)量,g;

m2——稱取的果膠樣品質(zhì)量,g;

M——樣品質(zhì)量,g。

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定

(1) 酯化度:參照Silva等[17]的方法并修改。取0.1 g樣品加少量無水乙醇濕潤后溶于20 mL蒸餾水中,35 ℃水浴2 h,用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至8.2,加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液靜置2 h,加入10 mL 0.1 mol/L HCl溶液,用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至8.2,按式(2)計(jì)算果膠酯化度。

(2)

式中:

R——酯化度,%;

V1——第一次滴定NaOH溶液消耗體積,mL;

V2——第二次滴定NaOH溶液消耗體積,mL。

(2) 持水性和持油性:參照Saeidy等[18]的方法并修改。取0.1 g樣品于離心管中,加入20 mL蒸餾水(或10 mL花生油),混勻攪拌1 min,8 000 r/min離心10 min,除去上清液,記錄離心管與樣品總質(zhì)量,按式(3)計(jì)算持水性和持油性。

(3)

(4)

式中:

X1——持水力,g/g;

X2——持油力,g/g;

m1——樣品質(zhì)量,g;

m2——樣品吸水前質(zhì)量,g;

m3——樣品吸水后質(zhì)量,g;

m4——樣品吸油前質(zhì)量,g;

m5——樣品吸油后質(zhì)量,g。

(3) 蛋白質(zhì)含量:參照Aklilu等[19]的方法。

(4) 乳化性和乳化穩(wěn)定性:參照Saeidy等[18]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,采用Excel和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量對(duì)果膠提取率的影響 由圖1可知,隨著植物乳桿菌接種量的增加,果膠提取率呈先上升后下降再逐漸趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為12%時(shí),果膠提取率達(dá)最大(8.10%)。繼續(xù)增大接種量,果膠提取率下降,可能是接種量過多,發(fā)酵底物中的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡,不足以維持菌種生長、產(chǎn)酶及產(chǎn)酸,從而導(dǎo)致果膠提取率下降[20]。因此,接種量取12%左右進(jìn)行正交試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響 由圖2可知,發(fā)酵初期,果膠提取率隨發(fā)酵時(shí)間的延長有一定增加,發(fā)酵至24 h時(shí)果膠提取率(9.08%)達(dá)最大;隨后果膠提取率趨于平穩(wěn)。在乳酸菌發(fā)酵提取貢水白柚皮膳食纖維中也存在類似現(xiàn)象[21],可能是發(fā)酵初期乳酸菌產(chǎn)生了一定量的酶和酸,促進(jìn)果膠釋放,而24 h后發(fā)酵底物中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗,菌種生長及產(chǎn)酸能力下降,從而導(dǎo)致果膠提取率下降[22-23]。因此,發(fā)酵時(shí)間取24 h左右進(jìn)行正交試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 液料比對(duì)果膠提取率的影響 由圖3可知,隨著液料比的增加,果膠提取率呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)液料比>20∶1 (mL/g)時(shí),果膠提取率穩(wěn)定在8.31%左右。植物乳桿菌發(fā)酵過程中,會(huì)產(chǎn)生一定量的酶和酸,隨著液料比的增加,發(fā)酵液中各營養(yǎng)物質(zhì)將達(dá)到最適發(fā)酵濃度,促進(jìn)酶與酸的產(chǎn)生,從而增強(qiáng)與柚子果實(shí)的作用,果膠提取率提高;但液料比增加到一定程度時(shí),發(fā)酵液中的酸與酶對(duì)柚子果實(shí)的作用達(dá)到平衡,增加液料比,果膠提取得率不會(huì)再增加[22]。因此,液料比取25∶1 (mL/g)左右進(jìn)行正交試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇合適的參數(shù)范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化,試驗(yàn)因素水平見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知,最佳的發(fā)酵條件為接種量14%,液料比25∶1 (mL/g),發(fā)酵時(shí)間12 h;各因素對(duì)果膠提取率的影響由大到小依次為料液比>發(fā)酵時(shí)間>接種量。

植物乳桿菌發(fā)酵未成熟琯溪蜜柚果實(shí)提取果膠的最優(yōu)工藝條件為接種量14%、料液比25∶1 (mL/g)、發(fā)酵時(shí)間12 h,在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得果膠平均提取率為11.60%,與表2中最大果膠提取率相似。

2.3 未成熟琯溪蜜柚果實(shí)果膠性質(zhì)分析

經(jīng)檢測(cè),采用植物乳桿菌發(fā)酵法提取的未成熟琯溪蜜柚果實(shí)中果膠的半乳糖醛酸含量為26.13%、酯化度為68.58%、蛋白質(zhì)含量為1.57%、持水性與持油性分別為0.53,7.01 g/g、乳化性以及乳化穩(wěn)定性分別為14.33%和33%。檢測(cè)數(shù)據(jù)表明,IPF果膠屬于高酯化度果膠,根據(jù)高酯化度果膠對(duì)酸度(pH<3.5)和糖度(>55%)的要求,該IPF果膠可應(yīng)用于果醬、糖果以及酸奶等食品工業(yè)。持水性與持油性主要受果膠密度及表面微觀結(jié)構(gòu)等特性影響,在食品工業(yè)用于改善產(chǎn)品的硬度和黏度[24]。IPF果膠的持水性與持油性略高于Muoz-Almagro等[25]提取的漿果果膠,可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶作用于IPF中的果膠,使其結(jié)構(gòu)被破壞,呈疏松多孔狀,從而增大了水或油與果膠的接觸面積,因此持水性和持油性增大[26];IPF果膠中蛋白質(zhì)含量符合糧農(nóng)組織的建議(<15.6%),其乳化活性和乳化穩(wěn)定性低于李揚(yáng)[27]提取的狐臭柴葉片果膠,可能與蛋白質(zhì)含量會(huì)影響果膠的乳化性能有關(guān)[28]。

3 結(jié)論

利用植物乳酸菌發(fā)酵提取未成熟琯溪蜜柚果實(shí)中的果膠,其最適提取工藝條件為乳酸菌接種量14%、液料比25∶1 (mL/g)、發(fā)酵時(shí)間12 h,此條件下果膠提取率為11.60%,半乳糖醛酸含量為26.13%、酯化度為68.58%、蛋白質(zhì)含量為1.57%、持水性與持油性分別為0.53,7.01 g/g、乳化活性以及乳化穩(wěn)定性分別為14.33%和33%。試驗(yàn)僅探究了發(fā)酵因素對(duì)果膠提取率的影響,后續(xù)可以對(duì)果膠的其他性質(zhì)如凝膠性、熱穩(wěn)定性或結(jié)構(gòu)等進(jìn)行深入分析。