金花葵中黃酮的提取及純化研究進(jìn)展

賈 娟，陳 品，王婷婷，李艷秋

（1.河南工業(yè)大學(xué)漯河工學(xué)院，河南 漯河 462002；2.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 漯河 462002；3.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

金花葵是一年生植物，隸屬于錦葵科黃秋葵屬，被稱為“菜芙蓉”和“植物界的熊貓”[1]。《順德府志》中記載金花葵在明朝就已經(jīng)存在，2003 年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院再次在河北邢臺地區(qū)發(fā)現(xiàn)了金花葵。金花葵自然分布在河北地區(qū)，仿野生金花葵大量種植在河南、河北地區(qū)。金花葵喜歡溫暖、陽光充足的地方，耐高熱，耐嚴(yán)寒，對土壤的要求也不是很苛刻，因此除了在極寒地區(qū)不能很好地生長以外，在其他地區(qū)都可以種植。

金花葵的花無毒，具有祛濕熱、消炎、鎮(zhèn)痛的作用；果實(shí)和籽也是寶，具有保護(hù)脾胃、提高食欲和治療跌打損傷等作用[2]。金花葵具有較高的藥用價(jià)值，含有很多營養(yǎng)成分，如生育酚、多糖膠、微量元素、纖維素等。此外，金花葵含有較高的黃酮類化合物。隨著國內(nèi)外研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗衰老、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗突變、抑制腫瘤細(xì)胞等功能，越來越受到人們的重視和認(rèn)可，這類化合物被廣泛的應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)[3-4]。因此，對黃酮類化合物的提取、純化與應(yīng)用已經(jīng)成為醫(yī)藥、食品、生物工程等領(lǐng)域的重要課題。本文就近10 年來國內(nèi)外學(xué)者對黃酮類化合物的提取分離純化方法進(jìn)行綜述，旨在為合理開發(fā)利用金花葵資源，為黃酮類產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的理論參考依據(jù)。

1 金花葵黃酮提取方法

1.1 超聲波輔助提取法

超聲輔助提取主要利用空化效應(yīng)來破壞植物細(xì)胞，使溶劑滲透到植物細(xì)胞中，從而在短時(shí)間內(nèi)把黃酮類化合物提取出來，提取時(shí)間短，溫度低，雜質(zhì)少，適用范圍廣[4-5]。宋琳琳等[5]利用超聲波輔助提取工藝提取金花葵黃酮，最佳提取條件為乙醇濃度80%、液料比25∶1、提取時(shí)間35 min，提取率為8.47%。申利英等[6]利用響應(yīng)面法對超聲波輔助提取金花葵中黃酮進(jìn)行了研究，在提取溫度31.97 ℃、乙醇濃度50.56%、料液比1∶21.22、提取時(shí)間31.92 min 的條件下，得到金花葵中黃酮的提取率為50.52%。周宇涵等[7]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取金花葵總黃酮，最佳工藝為乙醇濃度75%，浸泡時(shí)間2.1 h，顆粒大小為45 目，總黃酮提取率的預(yù)測值為18.64%，實(shí)測平均值為18.03%。賈娟等[8]采用超聲波提取法提取金花葵莖部黃酮，最佳提取工藝為液料比為30∶1（mL/g），乙醇濃度40%，時(shí)間20 min，pH5.0，提取1 次，此條件下粗黃酮得率為1.15%。超聲波提取法是提取金花葵黃酮最常用的方法，主要原因是超聲波提取法作為一種較為溫和的提取方法對目標(biāo)化合物成分的影響較小；同時(shí)，采用不同的條件提取黃酮，對黃酮類化合物提取率的影響也大不相同，由此可見，超聲波對黃酮類化合物的提取仍有較大優(yōu)化空間。

1.2 微波輔助提取法

微波輔助萃取是使用微波技術(shù)來進(jìn)行萃取，微波輔助主要使用其熱效應(yīng)。因?yàn)楹兴蜆O性有效成分的植物細(xì)胞在微波場中吸收了大量的熱量，因而產(chǎn)生內(nèi)部熱效應(yīng)使提取物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)分解，細(xì)胞外的溶劑很容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部溶解和釋放胞內(nèi)物質(zhì)。微波輔助提取具有快速高效、加熱均勻和操作簡單的特點(diǎn)，是常用的提取手段的一種[9-10]。Qiu[11]采用微波輔助法提取金花葵花中黃酮，最佳工藝為乙醇濃度70%、提取時(shí)間30 s、微波功率360 W、料液比1∶50、顆粒度小于80 目，此時(shí)黃酮提取率為5.673%。提取溫度和提取時(shí)間是微波提取法相對重要的因素，在劇烈的物理因素作用下，提取時(shí)間的微小差異都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；微波提取效果和等效擴(kuò)散系數(shù)直接聯(lián)系，因此對于不同物質(zhì)狀態(tài)的原料要選用合適的料液比，以得到相對最優(yōu)的等效擴(kuò)散系數(shù)。

1.3 索氏提取法

金花葵花中黃酮用索氏提取法進(jìn)行提取效果也較好。索氏提取器最初被用來提取牛奶中的脂類化合物，后來多被用來提取植物中的黃酮，主要運(yùn)用溶劑回流和虹吸原理進(jìn)行萃取。索氏提取法具有較好的選擇性、能耗低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但是相比較微波提取和超聲波提取，需要較長的提取時(shí)間[12-13]。張路等[14]用索氏提取法提取金花葵的根中的總黃酮，通過正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，料液比1∶35，在80 ℃的溫度下提取3 h，在此條件下黃酮的提取率可達(dá)到4.55%。索氏提取法的最大缺點(diǎn)是耗時(shí)較長，且對于不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的樣品，提取條件不同，提取效果差異也會較大。

1.4 超高壓提取法

超高壓提取技術(shù)是一種先進(jìn)的提取技術(shù)，常溫下將100～1 000 MPa 的流體靜壓力作用于反應(yīng)體系，使植物細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生較大的壓差，細(xì)胞壁發(fā)生破裂，使細(xì)胞中的物質(zhì)得到充分釋放，從而促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至提取溶劑中的方法，由于提取溫度低、提取時(shí)間短，故對有效成分破壞小，此方法具有健康、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，近年來，在植物活性成分的提取方面得到應(yīng)用[15]。王雪竹等[16]通過響應(yīng)面法優(yōu)化金花葵總黃酮超高壓提取的工藝條件，得出在壓力400 MPa、提取時(shí)間4.5 min、乙醇濃度80%的條件下，總黃酮得率達(dá)到145.32 mg/g。佘迪等[17]通過響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取金花葵根部黃酮的工藝條件，在壓力400 MPa、保壓時(shí)間8.3 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%優(yōu)化條件下，黃酮得率為（3.87±0.13）%。與其他提取技術(shù)相比，超高壓提取技術(shù)有無可比擬的優(yōu)勢，由于可在常溫下進(jìn)行操作，對熱不穩(wěn)定的提取物有一定的保護(hù)作用，得率相對較高。此外，超高壓提取不產(chǎn)生廢料，符合綠色環(huán)保的趨勢，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

2 金花葵黃酮純化方法

2.1 大孔吸附樹脂法

大孔樹脂是一種有機(jī)高聚物吸附劑且具有很好的吸附功能和穩(wěn)定性，對不同物質(zhì)的吸附性與樹脂的極性有關(guān)，利用這一特點(diǎn)可以有效地將所需的有效成分提取出來。大孔樹脂吸附工藝是分離純化黃酮類化合物最常用的一種方法，穩(wěn)定性、選擇性好[18-19]。王蕾等[20]為研究分離純化金花葵莖葉中總黃酮的最佳條件，選擇LX-J 系列、DM130、D101、AB-8 等10 種大孔樹脂，以金花葵莖葉中總黃酮的含量為參考指標(biāo)，篩選出其中最優(yōu)樹脂，通過試驗(yàn)得到了最佳純化條件，即樣液濃度3 mg/mL，pH值5.0，吸附流速3 BV/h，過柱次數(shù)3 次，70%乙醇的洗脫速率4 BV/h 的條件下，LX-J24 大孔樹脂對總黃酮的吸附與解吸效果均為最佳，金花葵莖葉中總黃酮的含量提取率為78.06%，純度高達(dá)57%。張?jiān)虑賉21]利用AB-8 大孔樹脂對金花葵總黃酮提取物進(jìn)行純化，去除水溶性雜質(zhì),金花葵黃酮含量增高,洗脫液真空濃縮后,經(jīng)冷凍干燥后得到黃棕色粉末。

2.2 膜分離法

膜分離法是選擇具有分離功能的天然或合成的膜材料作為分離介質(zhì)，在濃度差、壓力差或電位差等作用下，將不同分子量區(qū)段組分分離、純化、濃縮的新型分離技術(shù)。這種方法可以在常溫下進(jìn)行，保護(hù)有效成分、樣本量大、操作簡單、能耗低、廣泛的應(yīng)用在醫(yī)藥和食品工業(yè)中[22]。目前膜分離技術(shù)在金花葵的分離純化上未見報(bào)道，但隨著膜分離技術(shù)的發(fā)展，分離純化的特點(diǎn)明顯，優(yōu)勢顯著，膜分離技術(shù)越來越受到大家的重視，尤其在植物的分離純化中應(yīng)用前景好，金花葵黃酮的分離純化可以參照其在其他物質(zhì)上的應(yīng)用，如滕春麗[23]利用HPS-100 超濾膜分離技術(shù)對紅托竹蓀多糖進(jìn)行分離純化，將多糖含量提升至71.73%。羅愛勤等[24]采用膜分離法制備靈芝孢子多糖得率高于醇沉法，為（4.61±0.28）%；LI 等[25]采用截留不同相對分子質(zhì)量的2 個(gè)納濾膜，從大豆發(fā)酵液中分離純化低聚糖，得率83.2%，多糖含量77.9%。Cai 等[26]將微濾、超濾、納濾膜集成膜分離系統(tǒng)，從猴頭菌中分離粗寡糖，得率14.8%，寡糖含量63.7%。

2.3 高速逆流色譜技術(shù)

高速逆流色譜技術(shù)又稱為離心分配色譜、液-液分配色譜，是一種兩互不相溶的液體體系分別作為固定相和流動相，進(jìn)行續(xù)有效液液分離，溶質(zhì)在兩相中分配分離的色譜技術(shù)。這種分離提純技術(shù)為可逆吸附、樣品損失小、提高了回收率、分離速度快、降低成本等特點(diǎn)，在生物制藥、活性成分分離等方面具有較大應(yīng)用價(jià)值[27-29]。目前高速逆流色譜技術(shù)在金花葵的分離提純上未見報(bào)道，但因其提純物純凈、制備量大、技術(shù)成本低等優(yōu)點(diǎn)，正在發(fā)展成為一種備受關(guān)注的新型液液分配色譜分離純化技術(shù)，廣泛應(yīng)用于天然藥物有效成分的分離，制備金花葵黃酮的分離純化可以參考其他的物質(zhì)上的應(yīng)用，如姜姣姣等[30]以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5∶5∶3∶7，V/V/V/V）為溶劑系統(tǒng)，采用高速逆流色譜技術(shù)對藜蘆中的甾體類生物堿進(jìn)行分離鑒定，藜蘆酰棋盤花胺和介芬胺的純度分別為91.34%、98.10%。尹雪蓮[31]以正己烷-甲醇-水（14∶7∶0.06，V/V/V）分離體系，采用高速逆流色譜法對乙酯型鳀魚油進(jìn)行分離提純棕櫚油酸，含量為70.57%，純度可達(dá)（94.89±0.68）%。宋道光等[32]以正己烷/正丁醇/水/冰乙酸（系統(tǒng)I：1∶2∶1∶0.1，V/V/V 和系統(tǒng)II：1∶1∶1∶0.1，V/V/V/V）為溶劑系統(tǒng)，從小葉金錢草中分離四種黃酮苷類化合物,其純度均大于95%。吳雪[33]采用30%磷酸二氫鈉-乙醇-丙酮（6∶2∶1.5，V/V/V）為溶劑體系，通過高速逆流色譜法，分離麥芽糖基-β-環(huán)糊精，并鑒定其純度，其最高純度為93.2%。

3 金花葵黃酮測定方法

3.1 分光光度法

分光光度法經(jīng)常被用來測定樣品中的黃酮含量，它需要在一定的波長范圍中測定吸光度，方法簡便，靈敏度高。使用分光光度法測定黃酮含量時(shí)，需要先確定黃酮的吸收波長，然后在這個(gè)波長下使用分光光度計(jì)來得到樣品的吸光值，使用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品得到回歸方程，然后根據(jù)回歸方程計(jì)算出黃酮含量。分光光度法操作簡單，但是速度快，準(zhǔn)確度相對不高。曹東怡等[34]利用分光光度法在508 nm 下測定不同部位金花葵黃酮含量，其中花中總黃酮含量最高，達(dá)22 299.62 μg/g，其余部位（種子、果皮、莖、根）總黃酮含量均低于4 000.00 μg/g。張曉嬌等[35]利用分光光度計(jì)法（測定波長510 nm）對金花葵花冠中黃酮含量進(jìn)行了測定，其黃酮含量為（43.23±0.56）mg/g。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在完成各成分的分離之后，進(jìn)入檢測器檢測的方法，分析速度快，一般情況下15～30 min就可以分析一個(gè)樣品，適用范圍廣，且對于熱穩(wěn)定性比較差的化合物的分析也有一定的優(yōu)勢。吳正超等[36]利用高效液相色譜法對金花葵中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了定量分析，得到平均加標(biāo)回收率為95.20%～109.48%，RSD 小于2.24%，表明該方法檢測準(zhǔn)確且精密度較好，可實(shí)現(xiàn)金花葵花黃酮類成分快速鑒定，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。高效液相色譜法效率高、靈敏度高，但是分析成本高。在進(jìn)行黃酮含量測定時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇測定方法。

4 展望

金花葵中含有大量的黃酮類化合物，具有較高的營養(yǎng)和開發(fā)價(jià)值。對提取及純化金花葵中的黃酮進(jìn)行研究，有利于更好地利用金花葵資源，服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)。黃酮的提取工藝還有很多，如酶輔助提取技術(shù)、超臨界萃取技術(shù)。酶輔助提取技術(shù)是一種利用酶來提取物質(zhì)的一種工藝，酶可以有效地分解植物組織并保留提取物中的有效成分，因此可以用酶來輔助提取。酶輔助提取法可以軟化植物細(xì)胞壁使有效成分流出，從而提升提取率，通常可以使用纖維素酶、果膠酶等酶來進(jìn)行提取，這種工藝很適合用來提取植物中的成分；同時(shí)，酶輔助提取工藝不僅操作簡便而且比較環(huán)保，是提取工藝的研究熱點(diǎn)[37]。使用酶輔助提取工藝提取金花葵中黃酮的研究還比較少，這種方法目前多被應(yīng)用在其它天然植物活性成分的提取上，它的提取效果也很好，可以使用這種方法來提取金花葵中黃酮。超臨界萃取技術(shù)以超臨界流體為萃取劑，把萃取物從混合物中分離出來，具有安全性高、萃取速度快能耗低等特點(diǎn)。高壓脈沖電場技術(shù)通過使用高壓脈沖電場對樣品進(jìn)行處理，來增加細(xì)胞質(zhì)膜的通透性而造成細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)流出，可以用來提取黃酮[38]。將兩種提取工藝相結(jié)合會得到更好的提取效果。

金花葵渾身都是寶，金花葵類產(chǎn)品在市場上具有很大的發(fā)展前景，市場上對金花葵相關(guān)產(chǎn)品的需求也很大。同時(shí)，對金花葵中黃酮提取和純化的進(jìn)一步研究也刻不容緩，優(yōu)化金花葵中黃酮的提取工藝、增強(qiáng)金花葵中黃酮的提取效果，可以最大程度利用金花葵資源，這不僅對提取純化黃酮的研究具有極大的意義，而且能更好的為地方經(jīng)濟(jì)服務(wù)。