灰霉病致病機(jī)理及其防治措施研究進(jìn)展

王方方，付清泉，史學(xué)偉，王 斌

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

灰霉病是由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的一種常見真菌病害，發(fā)生在植物的莖、葉、花、果實(shí)和種子等部位[1]，可以引起1 000 多種果蔬發(fā)病，受到侵染的果蔬表面會(huì)出現(xiàn)白色或灰色的霉斑，受感染的部位會(huì)出現(xiàn)軟腐爛和褐變，在全球范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（超過100 億美元）[2]。B.cinerea 更容易侵染受損或衰老組織，導(dǎo)致植物損傷嚴(yán)重甚至死亡，并且具有傳播速度快、寄主范圍廣和病原菌遺傳變異性高等特點(diǎn)，被稱為世界第二嚴(yán)重植物病原體[3]。研究表明，B.cinerea 通過侵入寄主的表皮進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生一些細(xì)胞降解酶（CWDEs）[4]、毒素[5]、有機(jī)酸[6]等物質(zhì)來調(diào)控灰霉病的發(fā)病，或者通過基因來調(diào)控灰霉病的發(fā)病[7]。針對(duì)B.cinerea 引發(fā)的果蔬腐敗有多種防治方法，包括化學(xué)防治[8]、農(nóng)業(yè)防治[9]和生物防治[10]，這些方法均是通過降低菌體感染率來控制灰霉病的爆發(fā)。

本文總結(jié)了植物生長過程中不同部位（葉片、花序和果穗）感染灰霉病的主要癥狀，影響植物灰霉病發(fā)病的重要因素，B.cinerea 致植物灰霉病的分子機(jī)理，以及植物灰霉病防治技術(shù)，旨在為果蔬灰霉病防治相關(guān)研究提供理論參考。

1 灰霉病的癥狀及發(fā)病特征

1.1 癥狀

B.cinerea 對(duì)植物的危害分布在植物生長的整個(gè)時(shí)期，從葉片部位一直到花序、果穗都可能受到危害。首先會(huì)侵染葉片，主要表現(xiàn)為葉片多從葉尖或葉邊緣開始發(fā)病，葉片邊緣有棕色“U”或“V”形損傷，出現(xiàn)淡褐色且不規(guī)則病斑，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病斑呈現(xiàn)不規(guī)則輪紋，環(huán)境較潮濕時(shí)，病葉組織的下側(cè)可以觀察到大量的灰色孢子[11]。對(duì)花序、果穗的危害主要分為兩個(gè)時(shí)期：第一個(gè)時(shí)期是在開花前及幼果時(shí)期，花序被病菌感染初期呈淡褐色水漬狀，后期發(fā)病部位逐漸轉(zhuǎn)為暗褐色，病部組織軟腐，進(jìn)一步發(fā)展至萎蔫甚至壞死[12]。第二個(gè)時(shí)期是在果實(shí)著色至成熟期階段，果穗上的果實(shí)呈火柴頭大小時(shí)就會(huì)染病，產(chǎn)生淡褐色、水浸狀病斑，后病斑變?yōu)楹稚玔13]。漿果在早期受到侵染時(shí)會(huì)出現(xiàn)圓形的凹陷病斑，雖然果實(shí)的硬度沒有受到影響，但果皮上出現(xiàn)的病斑顏色和正常組織的顏色相比較淺[14]。

1.2 發(fā)病特征

B.cinerea 是一種壞死性兼性腐生病菌，對(duì)外界環(huán)境的要求不高，其不僅會(huì)在田間發(fā)病，還會(huì)在貯藏、運(yùn)輸過程中造成感染，進(jìn)而引起果蔬腐爛，質(zhì)量下降等不良效果[15]。B.cinerea 擁有廣泛的寄主范圍和多種攻擊模式[16]，并對(duì)多種水果、谷類、葉菜、豆類產(chǎn)生病害，尤其會(huì)影響葡萄、草莓、番茄等農(nóng)作物產(chǎn)量，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[17]。B.cinerea 主要以菌絲體或菌核隨病殘?bào)w在土壤中越夏或越冬，病原菌萌發(fā)產(chǎn)生的分生孢子和菌絲，會(huì)伴隨空氣、雨水和人類的生產(chǎn)活動(dòng)等方式進(jìn)行傳播[18]。外界環(huán)境主要是冠層內(nèi)的小氣候條件會(huì)影響灰霉病的發(fā)病，其中的溫度和濕度（相對(duì)濕度和自由濕度）更是B.cinerea 感染的關(guān)鍵因素[19]。當(dāng)相對(duì)濕度低于81%時(shí)，分生孢子不能萌發(fā)，在90%～98%時(shí)開始大量萌發(fā)，分生孢子在0～30 ℃之間萌發(fā)，最適溫度為20～25 ℃[20]。B.cinerea 是一種適應(yīng)偏低溫度和較高濕度的病原菌，當(dāng)外界環(huán)境持續(xù)低溫、高濕或光照不足時(shí)，植物更容易受到感染，導(dǎo)致嚴(yán)重發(fā)病[21]。除了溫度和濕度影響灰霉病的發(fā)病外，各地區(qū)品種的不同[22]、大氣CO2濃度[23]、定植密度過大[24]、施肥不科學(xué)[25]、生長調(diào)節(jié)劑超量使用[26]等因素都對(duì)灰霉病的發(fā)病有誘導(dǎo)作用。

2 B.cinerea 的致病機(jī)理

B.cinerea 對(duì)宿主的致病過程包括侵入宿主表皮，殺死植物細(xì)胞和引起組織腐爛三個(gè)階段[27]。在致病過程由多種毒素、酶、代謝物、基因等因素共同調(diào)控[5]。

2.1 侵入表皮

分生孢子高度豐富且普遍存在，主要通過傷口或自然開口進(jìn)入宿主細(xì)胞[28]。植物細(xì)胞壁是保護(hù)植物細(xì)胞應(yīng)對(duì)外來風(fēng)險(xiǎn)的一道屏障，主要是由中膠層、初生壁以及次生壁構(gòu)成，其成分主要是多糖和蛋白質(zhì)，如果膠、纖維素和半纖維素等物質(zhì)[29-30]。作為一種壞死性真菌，B.cinerea 附著胞體的強(qiáng)度不足以破壞植物細(xì)胞壁，且由B.cinerea 造成的植物表皮損傷以及機(jī)械損傷現(xiàn)象很少見，但B.cinerea 能分泌一系列細(xì)胞壁降解酶（CWDEs），降解宿主細(xì)胞壁，從而侵入宿主表皮[31]，例如分泌果膠酶和纖維素酶[29]、多酚氧化酶[32]、蛋白酶和磷酸酯酶[33]、木聚糖酶[34]、淀粉酶[35]等物質(zhì)。其中果膠酶和纖維素酶是重要的兩個(gè)酶，果膠酶靶向作用于細(xì)胞壁中的大多數(shù)多糖，導(dǎo)致細(xì)胞壁裂解[29]。果膠酶和纖維素酶在協(xié)同作用下能促使細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞與解離，細(xì)胞壁被降解后會(huì)引起組織軟化，進(jìn)而使得表皮的保護(hù)屏障受損，由此增加了擦傷的可能性，并為真菌提供了單糖作為碳源的途徑，有利于B.cinerea 的侵入、定殖和擴(kuò)展[3]。此外，B.cinerea 還具有六種不同降解細(xì)胞壁的聚半乳糖醛酸酶（PGs）基因，它們是可以介導(dǎo)宿主相互作用和潛在宿主強(qiáng)化基因的強(qiáng)活性代謝物，其中多聚半乳糖醛酶是主要的降解酶，也是致病因子之一[36]。

2.2 殺死植物細(xì)胞

B.cinerea 裂解宿主細(xì)胞壁以達(dá)到破壞其表皮保護(hù)屏障的效果，在細(xì)胞壁裂解后會(huì)進(jìn)一步侵入寄主細(xì)胞組織，破壞植物細(xì)胞，從而加速灰霉病的發(fā)生[37]。

2.2.1 毒素的致病作用

在B.cinerea 侵入植物表皮的過程中，會(huì)分泌一些植物毒性代謝物，主要為高倍半萜烯葡萄孢素（Sesquiterpen botrydial）和高取代內(nèi)酯（Botcinolide）[31]。其中高倍半萜烯葡萄孢素是非特異性毒素且毒性最高，可以作用于多種農(nóng)作物和基因，其侵染植物的能力很強(qiáng)，更容易引發(fā)感染[17]。除了這兩種毒素之外，草酸也是重要的植物毒性代謝物[29]?；移咸焰呙狗置诓菟峥梢越档椭参锛?xì)胞內(nèi)pH 值并刺激果膠酶、蛋白酶等真菌酶的產(chǎn)生和活性。此外，草酸積累導(dǎo)致Ca2+螯合，進(jìn)而削弱植物細(xì)胞壁的果膠結(jié)構(gòu)[3]。這些毒素在B.cinerea 侵染中發(fā)揮著重要的作用，能夠破壞細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)胞的質(zhì)壁分離和細(xì)胞器的損傷，加速B.cinerea 的侵染，同時(shí)也會(huì)使宿主產(chǎn)生褐色病斑、白化或者枯萎等癥狀，對(duì)宿主造成不同程度的危害[38]。

活性氧（ROS） 是公認(rèn)植物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，包括超氧陰離子（O2-·）、羥基自由基（-OH）和某些非自由基氧化劑如氫過氧化物（H2O2）和臭氧（O3），可以轉(zhuǎn)化為自由基[4]。在水果受到B.cinerea 侵染或生物、非生物因素脅迫時(shí)，植物與病原體相互作用會(huì)短時(shí)間產(chǎn)生大量的活性氧[39]。ROS 對(duì)入侵病原體具有直接的細(xì)胞毒性，可能通過促進(jìn)角質(zhì)層聚合物的氧化來滲透宿主細(xì)胞，ROS的過度產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)，由此造成大量H2O2的積累，最終可誘導(dǎo)超敏反應(yīng)（HR） 的程序性死亡（PCD），宿主中高濃度的ROS 和隨后的細(xì)胞死亡阻礙了生物營養(yǎng)病原體的傳播[5]。

2.2.2 基因的調(diào)控

親環(huán)蛋白（Cyp）是與真菌形態(tài)發(fā)生和產(chǎn)生毒力相關(guān)的成分[36]。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）已被證明是鑒定致病性相關(guān)基因的方法，通過ATMT 法表明了BcCYP2 是灰霉病菌產(chǎn)生毒力的相關(guān)基因，BcCYP2 的破壞不會(huì)損害病原體的菌絲生長、滲透、氧化和細(xì)胞壁的完整性，但會(huì)延遲分生孢子的萌發(fā)，改變分生孢子的形態(tài)，以及減少感染墊（IC）的形成，產(chǎn)生毒力降低的效果[40]。低聚半乳糖醛酸酶（Oligogalacturonase）被認(rèn)為是植物防御反應(yīng)的激發(fā)因子，它的分泌減少會(huì)降低植物的防御反應(yīng)[41]。通過克隆編碼BcPg1 基因進(jìn)行試驗(yàn)，表明BcPg1 不會(huì)顯著影響初始感染的頻率，但可以觀察到參與試驗(yàn)的果實(shí)和葉片的損傷生長速率有了顯著的降低，表明BcPg1 與灰霉病的毒力有關(guān)[42]。此外富含半胱氨酸的受體樣激酶（CRKs）也是普遍存在的植物受體樣激酶，它在植物抗病中起著重要作用，在灰霉病栽培品種中VaCRK2 接種和茉莉酮酸甲酯處理后，抗灰霉病的葡萄品種中VaCRK2 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，引起致病機(jī)制相關(guān)基因（PR）的上調(diào)和活性氧（ROS）的積累，VaCRK2 能促使植物激活PR 基因的表達(dá)和氧化，從而對(duì)灰霉病病菌產(chǎn)生抗性[43]。除此之外還有BcVea[27]、Rho3[44]、Slt2-MAPK[45]、BOSI[46]等基因都是灰霉病病菌生長發(fā)育或致病的相關(guān)基因，都發(fā)揮著不同的作用。而且孢子的生長速率也和基因有著重要聯(lián)系，研究表明BcCYP2 介導(dǎo)B.cinerea 菌核的產(chǎn)生和形態(tài)發(fā)生，但對(duì)于孢子的萌發(fā)是必不可少的，bmp1 缺失突變體產(chǎn)生正常的分生孢子和菌絲體，但生長速度降低，說明孢子的生長速率和bmp1 有著不可分割的關(guān)系[47]。

3 防治措施

目前對(duì)灰霉病的防治策略為“預(yù)防為主，綜合防治”，主要通過化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治和生物防治技術(shù)對(duì)灰霉病進(jìn)行防治。

3.1 化學(xué)防治

化學(xué)防治主要通過噴灑農(nóng)藥進(jìn)行，是目前國內(nèi)使用最多的防治方法[9]。目前用于化學(xué)控制灰霉病的試劑主要包括苯并咪唑類、對(duì)二甲酯亞胺類、甲氧基丙烯酸酯類、環(huán)己酰胺、苯（芐）胺基嘧啶類、N-苯基氨基甲酸酯類等，具有高效、快捷、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)勢，其中最主要的殺菌劑為二甲酰亞胺類和苯胺基嘧啶類殺菌劑[48]。但是長期使用化學(xué)殺菌劑會(huì)引起植物的抗藥性，往往通過加大藥劑的使用量達(dá)到效果，而過度使用化學(xué)藥劑會(huì)造成藥劑的殘留，對(duì)人們健康存在潛在威脅，也會(huì)對(duì)環(huán)境、土壤造成污染，從而導(dǎo)致多方面的不利影響[49]。

通過對(duì)比不同殺菌劑對(duì)湖北省各地產(chǎn)區(qū)番茄和草莓采集的B.cinerea 的研究可知，腐霉利抗性菌株對(duì)二甲酰亞胺類殺菌劑存在正交互抗性，但對(duì)苯吡咯類殺菌劑沒有交互抗性[50]。而不同地區(qū)的草莓對(duì)于殺菌劑的抗藥性也不相同，通過對(duì)河北、北京、四川等6 個(gè)不同地區(qū)的草莓進(jìn)行樣本采集，考察不同的殺菌劑對(duì)B.cinerea 的抗藥性頻率，研究表明在灰霉病菌樣本群體為251 時(shí)，乙霉威、腐霉利、多菌靈抗藥性頻率分別為67.33%、45.02%和64.94%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)以上殺菌劑都具有敏感性的菌株僅有3 株且頻率為1.2%，而且對(duì)3 種殺菌劑全部表現(xiàn)抗藥性的菌株為17.53%，以上研究表明樣本草莓B.cinerea出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的多重抗藥性現(xiàn)象[51]。

為解決植物對(duì)化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗性這一現(xiàn)象，主要措施是將幾種化學(xué)殺菌劑進(jìn)行復(fù)合調(diào)配來延緩灰霉病的發(fā)病，但需要對(duì)殺菌劑的使用量進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)控，且針對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的植物對(duì)不同化學(xué)殺菌劑的抗藥性問題需要分析考察當(dāng)?shù)氐赜蛱卣?，進(jìn)一步確定合適的藥劑來對(duì)灰霉病進(jìn)行有效的控制[52]。

3.2 農(nóng)業(yè)防治

農(nóng)業(yè)防治主要通過選育優(yōu)良的抗病品種，在植物生長期階段清理病殘?bào)w[9]、控制溫度和濕度[3]、簇緊密度和稀疏、合理的人工輪作[53]、增加穿過和圍繞植物的光照和氣流[2]、衰老組織的物理去除等方式來降低灰霉病的感染率。

豇豆灰霉病主要通過農(nóng)業(yè)防治來控制灰霉病的發(fā)病，將豇豆與蔥蒜、禾木類植物進(jìn)行2～3 年的輪作或者將播種期提前因此來避開高溫和多雨時(shí)期，及時(shí)對(duì)種植地區(qū)的溫度、濕度、空氣等環(huán)境條件進(jìn)行調(diào)控和處理，防止灰霉病發(fā)生或控制灰霉病的發(fā)病[54]。河南一地區(qū)通過農(nóng)業(yè)防治、生態(tài)防治建立了綠色防控草莓示范基地，主要對(duì)草莓優(yōu)質(zhì)抗病的品種進(jìn)行選育或?qū)Σ葺M(jìn)行脫毒種苗、合理進(jìn)行肥料配比和施肥、及時(shí)摘除老葉和病葉，對(duì)有效抑制灰霉病的發(fā)病提供了一條綠色、高效、安全、環(huán)境友好的技術(shù)模式。在大棚草莓的灰霉病防治中僅僅只靠化學(xué)防治往往是不夠的，需要結(jié)合物理和生態(tài)的防治，特別是將已經(jīng)發(fā)生病害的葉片或組織及時(shí)摘除，防止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)散造成更加嚴(yán)重的病害，再加上對(duì)大棚內(nèi)濕度的控制、白天和晚上溫度的調(diào)整，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大棚內(nèi)草莓灰霉病的有效控制[55]。

雖然通過農(nóng)業(yè)防治來控制灰霉病的發(fā)生能延緩灰霉病的發(fā)生，但農(nóng)業(yè)預(yù)防局限性仍較大，尤其需要對(duì)外界溫度和濕度的要求十分嚴(yán)格，且需要及時(shí)地識(shí)別病害并且摘除病害，一旦控制不好會(huì)導(dǎo)致發(fā)病加劇[56]。

3.3 生物防治

生物防治對(duì)于灰霉病的控制具有較好的前景和潛力，因?yàn)槲⑸飳?duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，且菌種的來源廣泛、安全，表現(xiàn)出低污染、無毒殘留等優(yōu)勢[57]。目前用于生物防治灰霉病的菌種主要為細(xì)菌和酵母菌等，通過不同的菌種來控制不同植物的灰霉病是有效的。拮抗生物的主要作用機(jī)制是通過寄生植物的寄生、營養(yǎng)的競爭、誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）、誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性（ISR）等多種防御機(jī)制的產(chǎn)生來防治灰霉病[58]。

用于生物防治的細(xì)菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等?？莶菅挎邨U菌NSW-3-1 是從黨參中篩選出來的一株具有較強(qiáng)抑制作用的細(xì)菌，當(dāng)發(fā)酵液菌種濃度為1×108CFU/mL 時(shí)防治的效果最好，并且該菌株不僅有很好的抑制作用，而且可以促進(jìn)黨參的生長，是一株良好的生物防治細(xì)菌[59]?？莶菅挎邨U菌L1-21 可以在植物內(nèi)部組織定殖，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，通過和B.cinerea 共同培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌L1-21 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的拮抗作用，且濃度越高疾病的發(fā)生率越低，從而達(dá)到了較好的控制效果[60]。從銀杏組織分離的內(nèi)生細(xì)菌菌株中篩選出來了一株B.cinerea 抑菌活性較好的解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為79.06%，能夠顯著抑制病原菌的菌絲生長。此外木霉DQ-1、貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1、印楝內(nèi)生放線菌R6 等植物中篩選出來的細(xì)菌都可以有效的控制灰霉病的發(fā)生且促進(jìn)植物的生長，是優(yōu)質(zhì)的細(xì)菌生物防治菌[61]。

酵母作為采后灰霉病的生物防治菌株具有很好的抗菌效果。從水果中篩選出來了一株美極梅奇酵母（Metschnikowia zizyphicola）T-2，它可以通過產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）來減少藍(lán)莓在貯藏期引起的果實(shí)腐爛，通過對(duì)藍(lán)莓在儲(chǔ)藏期品質(zhì)的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)、風(fēng)味指標(biāo)等指標(biāo)的測定發(fā)現(xiàn)美極梅奇酵母T-2 不會(huì)損害藍(lán)莓的品質(zhì)，且該菌株會(huì)誘導(dǎo)藍(lán)莓體內(nèi)的黃酮和酚類物質(zhì)的積累來提高藍(lán)莓的抗性，通過將藍(lán)莓經(jīng)過美極梅奇酵母T-2 的處理后平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其可直接抑制B.cinerea 的菌絲生長和孢子萌發(fā)[62]。白色念珠菌（Candida pseudolambica） 是一種常見于各種環(huán)境中的酵母，用從海洋中分離出來的一株白色念珠菌W-16 處理侵染B.cinerea 桃子的第3 天，發(fā)現(xiàn)灰霉病的發(fā)病率降低了41.2%，說明白色念珠菌W16 對(duì)桃子灰霉病的防治有較好的效果，且白色念珠菌W-16 產(chǎn)生的VOCs 抑制了B.cinerea 的菌絲生長和分生孢子的萌發(fā)，并引起了菌絲體形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的異常，但其不會(huì)對(duì)桃子的品質(zhì)產(chǎn)生影響[63]。美極梅奇酵母T-2、白色念珠菌W16 可以通過VOCs 與果實(shí)相互作用來提高其抗性和直接抑制B.cinerea 的生長，從兩個(gè)方面降低了宿主的發(fā)病率，除此之外還有解淀粉芽孢桿菌BP30、酵母菌KD-16J、間型假絲酵母C410 等多種酵母菌都可以較好的抑制灰霉病的發(fā)病[64]。

4 小結(jié)

灰霉病作為一種危害植物的真菌病害，嚴(yán)重時(shí)可以造成80%的減產(chǎn)，受到了人們廣泛的關(guān)注[65]?；颐共〉闹虏C(jī)制是多方面的，致病菌B.cinerea 通過侵入寄主表皮在植物組織中迅速生長，通過產(chǎn)生酶類、毒素、有機(jī)酸、基因等多方面影響植物生長。目前對(duì)灰霉病的控制主要通過化學(xué)、農(nóng)業(yè)及生物防治方法，但化學(xué)試劑的過量使用會(huì)造成環(huán)境的污染和農(nóng)藥殘留，嚴(yán)重危害了環(huán)境及人類健康，農(nóng)業(yè)防治工程量較大且不易控制，相較而言生物防治的安全、無毒無害等優(yōu)勢較明顯，應(yīng)該積極發(fā)展生物方面對(duì)灰霉病的防治，加快環(huán)境友好型微生物菌劑的研制、升級(jí)和示范推廣?？傊每商娲呗詠砜刂撇『Φ陌l(fā)生已經(jīng)成為了迫切的需求，安全、綠色、高效、可行的使用無公害綠色的防治手段日益受到了重視，成為今后科研的研究重點(diǎn)。