鐵死亡抑制因子KIF20A 對食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為及鐵死亡的影響

熱則耶·麥麥提祖農(nóng) ，李秀娟 ，劉 玲 ，李 卉

（1）新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;2）病理生理學(xué)教研室;3）中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830000）

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)國際癌癥研究中心全球統(tǒng)計報告顯示2020 年我國食管癌新發(fā)病例以及新增死亡病例均超過了世界總數(shù)的50 %[1]。食管癌有2 種組織學(xué)亞型，其中近90 % 的食管癌患者為食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者[2]。雖然ESCC 中晚期患者的治療方案正在不斷優(yōu)化，但患者5 a 生存率依然很低[3]。

鐵死亡是2012 年首次被提出的一種非凋亡形式的細(xì)胞死亡，其發(fā)生依賴于鐵離子，過多的鐵離子誘導(dǎo)更多的氧自由基產(chǎn)生，而不斷累積的氧自由基攻擊細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸，使其過氧化，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂，最終誘發(fā)細(xì)胞的死亡[4]。其實細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生來源有很多，由于細(xì)胞內(nèi)含有強大的抗氧化系統(tǒng)在不斷的阻斷和清除過多產(chǎn)生的氧化物，細(xì)胞才能在氧化和抗氧化物的動態(tài)平衡下維持著生命活動[5]。鐵死亡的發(fā)生受多基因的共同調(diào)控，通過前期生物信息學(xué)分析篩選出2 個ESCC 中高表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因，分別是RRM2 和KIF20A。其中KIF20A 被認(rèn)為是鐵死亡抑制因子[6]。此外，KIF20A 作為驅(qū)動蛋白家族成員，參與細(xì)胞有絲分裂過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，在多種腫瘤中發(fā)揮著促癌基因的作用[7]，而KIF20A 在ESCC 中的作用有待進(jìn)一步研究。該研究旨在探究KIF20A 對ESCC 細(xì)胞生物學(xué)行為以及鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

ULCAN（https://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個開放式癌癥數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站[8]，其可提供公開可用的癌癥OMICS 數(shù)據(jù)，其中包括癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）。從ULCAN 數(shù)據(jù)庫中獲取EC 及正常組織RNA-seq 數(shù)據(jù)。GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫是各種高通量數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫，從GEO 數(shù)據(jù)庫中獲取GSE75241 數(shù)據(jù)集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/GSE75241）其包含15 對ESCC 及配對正常組織的基因表達(dá)譜信息。FerrDb（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）是鐵死亡調(diào)節(jié)基因和鐵死亡相關(guān)疾病檢索及可獲取網(wǎng)站，從中獲取鐵死亡相關(guān)基因集。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購于美國Sigma-Aldrich 公司；青鏈霉素，RPMI1640 購于美國BI 生物公司，Opti-MEM，Lipofectamin3000 購于美國Thermo Fisher公司；10 % SDS-PAGE 凝膠試劑盒購于北京博泰斯生物技術(shù)有限公司；PVDH 膜購于瑞士Roche公司；脫脂奶粉購于德國Biofroxx 公司；KIF20A抗體購于美國Santa cruz 公司，型號sc-374 508；GAPDH 及山羊抗兔IGg、山羊抗鼠IGg 均購于北京博奧森公生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，型號BA00208；基質(zhì)膠Matrigel 購于美國BD 公司；Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室購于美國康寧公司；嘌呤霉素、ECL化學(xué)發(fā)光底物、4 % 多聚甲醛均購中國Biosharp公司；0.1 % 結(jié)晶紫、DMSO、GSH 檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒均購于北京索萊寶生物科技有限公司；鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 購于美國MCE 公司；全波長酶標(biāo)儀購于美國BIO RAD 公司；倒置顯微鏡購于日本Nikon 公司。

1.3 細(xì)胞株及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

本研究所用食管鱗癌Eca109 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。在10 % 胎牛血清+1 % 青鏈霉素+RPMI1640 完全培養(yǎng)基，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。KIF20A 敲低慢病毒由漢恒生物科技有限公司設(shè)計，分別是shKIF20A-1: CCGTTCCTGCA TGATTGTCAA，shKIF20A-2:CCGATGACGATGTCG TAGTTT，空載作為對照組。按照半體積病毒感染法進(jìn)行病毒感染，病毒MOI 值分別是30 和10。感染48 h 后以1 mg/L 的嘌呤霉素連續(xù)進(jìn)行3 次篩選。KIF20A 過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉凱基因公司設(shè)計，過表達(dá)質(zhì)粒在Opti-MEM 中稀釋，質(zhì)粒濃度分別是1.5 μg 和2 μg，用Lipofectamin3000 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，KIF20A 敲低組用sh-KIF20A 來表示，KIF20A 過表達(dá)組用OE-KIF20A 來表示。

1.4 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染效率

Western blot 實驗檢測KIF20A 敲低/過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率。蛋白樣品在10 % SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳，PVDF 膜濕轉(zhuǎn)1.5 h，用5% 脫脂牛奶封閉，抗體孵育KIF20A（1∶200），GAPDH（1∶4 000），4 ℃過夜，孵育二抗山羊抗兔IGg、山羊抗鼠IGg（1∶10 000）常溫1 h，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光底物顯影。結(jié)果在Fiji Image J v2.3.0（美國）軟件中進(jìn)行灰度值掃描。

1.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力

KIF20A 敲低/過表達(dá)細(xì)胞5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，實驗分組為KIF20A 敲低組和對照組、KIF20A 過表達(dá)組和對照組，每組分別設(shè)計3 個平行副孔，分別在12 h，24 h，36 h 和48 h 時更換含10 % CCK-8 溶液的培養(yǎng)基，用全波長酶標(biāo)儀在450 nm 測量吸光度。每次實驗至少設(shè)計3 個平行復(fù)孔，實驗均重復(fù)3 次。

1.6 Transwell 侵襲實驗

實驗前24 h 將所需基質(zhì)膠Matrigel 轉(zhuǎn)移至4 ℃，其以1∶8 比例與無血清培養(yǎng)基稀釋，5×10-5L/孔滴加至小室。待基質(zhì)膠成膜，上室為無血清培養(yǎng)基細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2.5×108個/L），下室為20%血清的完全培養(yǎng)基，實驗分組為KIF20A敲低組和對照組、KIF20A 過表達(dá)組和對照組，每組分別設(shè)計3 個平行副孔。培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行4%多聚甲醛固定，0.1 %結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下隨機拍取3 個視野，用Fiji Image J v2.3.0（美國）軟件計數(shù)。實驗重復(fù)3 次。

1.7 細(xì)胞劃痕實驗

實驗分組為KIF20A 敲低組和對照組、KIF-20A 過表達(dá)組和對照組，每組分別設(shè)計3 個平行副孔。KIF20A 過表達(dá)組實驗：將細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)90 % 時對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染說明，在轉(zhuǎn)染6 h 后進(jìn)行換液，隨后用200 μL 滅菌槍頭筆直劃線并拍照記錄，此時為0 h的遷移率。待48 h 后給細(xì)胞換液后進(jìn)行第2 次拍照，F(xiàn)iji Image J v2.3.0 軟件掃描劃痕面積，通過以下公式計算遷移率（0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積。KIF20A 敲低組實驗：將原先構(gòu)建的KIF20A 穩(wěn)定敲低及對照組細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行劃線，隨后步驟如同上述。每次實驗至少設(shè)計3 個平行復(fù)孔，實驗均重復(fù)3 次。

1.8 最佳藥物濃度篩選

鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 干粉劑在DMSO 中溶解，配制成10 mmol 的母液，隨后稀釋至以下濃度：0.1 μmol，0.5 μmol，1 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol，同時DMSO 為對照組。細(xì)胞按5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，每個濃度及對照組分別設(shè)計3 個平行副孔。加藥24 h 后在倒置顯微鏡下拍照，CCK-8 法測量吸光度。最后在Graphpad Prism9 軟件非線性擬合方式計算出半抑制濃度IC50值（half maximal inhibitory concentration）。

1.9 GSH 及MDA 含量測定

在Eca109 細(xì)胞中建立KIF20A 敲低/過表達(dá)模型后分別加入RSL3 誘導(dǎo)Eca109 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，通過檢測GSH 及MDA 含量以表示各組細(xì)胞間的鐵死亡水平。實驗分組為KIF20A 敲低組和對照組、KIF20A 過表達(dá)組和對照組，每組分別設(shè)計3個平行副孔。細(xì)胞處理24 h 后，研磨細(xì)胞取上清，分別用GSH 及MDA 試劑盒進(jìn)行含量測定。按照說明書操作步驟，GSH 提取統(tǒng)一每組細(xì)胞數(shù)為2.5×106個，加入5×10-4L 提取液，MDA 提取統(tǒng)一每組細(xì)胞數(shù)為5×106個，加入1×10-3L 提取液開展后續(xù)操作。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料兩獨立樣本組間比較，若服從正態(tài)分布且方差齊，采用兩獨立樣本t檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，不服從正態(tài)分布的計量資料采用非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIF20A 的生物信息學(xué)分析

首先，從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲取了食管癌差異表達(dá)的前50 個上調(diào)基因，見圖1A。GEO 數(shù)據(jù)庫中獲取GSE75241 作為驗證數(shù)據(jù)集，見圖1B，PCA 圖顯示此數(shù)據(jù)集癌和癌旁分組具有顯著區(qū)別，見圖1C。隨后從 FerrDb 中獲取鐵死亡相關(guān)基因，取三者交集，結(jié)果顯示有2 個重疊基因，分別是RRM2 和KIF20A，其中選擇KIF20A 為研究的目的基因，見圖1D。

圖1 KIF20A 的表達(dá)譜分析Fig.1 Analysis of expression profile of KIF20A

2.2 KIF20A 敲低及過表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建

以不同病毒滴度（MOI）構(gòu)建穩(wěn)定敲低細(xì)胞株（Eca109 細(xì)胞），采用Western blot 法檢測干擾效率。與對照組比較，shKIF20A-1 組MOI 值為30時目的分子表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），因此選取此條件開展后續(xù)實驗，見圖2A，2B。在Eca109 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染1.5 μg 和2 μg 質(zhì)粒，結(jié)果顯示KIF20A 質(zhì)粒濃度為2 μg 時目的分子表達(dá)量高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2C、圖2D。

圖2 Western Blot 檢測KIF20A 敲低/過表達(dá)效率[（），n=3]Fig.2 Western Blot detection of KIF20A knockdown/overexpression efficiency [（），n=3]

2.3 敲低/過表達(dá) KIF20A 對Eca109 細(xì)胞增殖能力的影響

通過CCK-8 法檢測各組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示KIF20A 敲低組細(xì)胞增殖能力在36 h 和48 h表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且吸光度值低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖3A～3B。KIF20A 過表達(dá)組細(xì)胞吸光度值在36 h 和48 h 高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見圖3C～3D。上述結(jié)果提示，KIF20A 影響Eca-109 細(xì)胞的增殖能力，并且起正向促進(jìn)作用。

圖3 CCK-8 法檢測KIF20A 敲低/過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力[（），n=3]Fig.3 The proliferation ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by CCK-8 assay [（），n=3]

2.4 敲低/過表達(dá) KIF20A 對Eca109 細(xì)胞侵襲能力的影響

實驗結(jié)果顯示，KIF20A 敲低組侵襲細(xì)胞數(shù)低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖4A～4B。KIF20A 過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見圖4C～4D。上述結(jié)果提示，KIF20A 促進(jìn)Eca109 細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 Transwell 侵襲實驗檢測KIF20A 敲低/過表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力[（），n=3]Fig.4 The invasion ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by Transwell invasion assay [（），n=3]

2.5 敲低/過表達(dá) KIF20A 對Eca109 細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，劃痕后48 h，KIF20A 敲低組細(xì)胞遷移能力明顯降低，愈合率低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5A～5B。KIF20A 過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力明顯升高，愈合率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5C～5D。以上結(jié)果提示，KIF20A對Eca109 細(xì)胞的遷移能力起正向促進(jìn)作用。

圖5 細(xì)胞劃痕實驗檢測KIF20A 敲低/過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力[（），n=3]Fig.5 Cell migration ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by cell scratch assay[（），n=3]

2.6 Eca109 細(xì)胞鐵死亡模型的構(gòu)建

給細(xì)胞分別加入濃度為0.1 μmol，0.5 μmol，1 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol 的RSL3 稀釋溶液，24 h 后CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，Eca109 細(xì)胞在RSL3 的作用下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，加藥組較DMSO組細(xì)胞，體積減小，形態(tài)顯皺縮，紅色箭頭所指，見圖6A～6B。此外，與對照組相比0.5 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol 組細(xì)胞活力降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見圖6C。進(jìn)一步計算得出Eca109 細(xì)胞的IC50值為5.128 μmol。

圖6 CCK-8 法檢測RSL3 誘導(dǎo)的Eca109 細(xì)胞活力[（），n=3]Fig.6 Eca109 cell viability induced by RSL3 was detected by CCK-8 [（），n=3]

2.7 敲低/過表達(dá) KIF20A 對Eca109 鐵死亡的影響

檢測各組細(xì)胞鐵死亡水平結(jié)果顯示，KIF20A敲低組細(xì)胞經(jīng)RSL3 誘導(dǎo)后GSH 含量低于對照組（P<0.05），見圖7A，而MDA 含量高于對照組（P<0.01），見圖7B。RSL3 誘導(dǎo)后，KIF20A 過表達(dá)組細(xì)胞GSH 含量高于對照組（P<0.05），見圖7C，MDA 含量低于對照組（P<0.001），見圖7D。以上結(jié)果提示，KIF20A 的下調(diào)可以增強細(xì)胞鐵死亡，而KIF20A 的高表達(dá)保護(hù)Eca109 細(xì)胞不發(fā)生鐵死亡。綜上所述，在Eca109 細(xì)胞中，敲低KIF20A的表達(dá)促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生，而過表達(dá)KIF20A 可以抑制細(xì)胞的鐵死亡。

圖7 GSH 和MDA 含量檢測[（），n=3]Fig.7 GSH and MDA content were detected [（），n=3]

3 討論

鐵死亡是一種新型的細(xì)胞死亡方式，其是鐵離子介導(dǎo)的氧自由基累積所誘發(fā)的氧化損傷過程[9]。ESCC 中關(guān)于鐵死亡的研究，早些年有報道顯示ESCC 患者血清中含有濃度較高的MDA，而抗氧化類酶的活性較低，研究結(jié)果提示ESCC 患者處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)[10]。隨后的研究也明確指出ESCC 組織中DNAJB6 的低表達(dá)減少對下游鐵死亡抑制因子 GPX4 的抑制作用，從而減少ESCC 中的鐵死亡[11]。類似的研究結(jié)果提示著ESCC 細(xì)胞通過抑制其本身的鐵死亡從而制造利于自身生長的環(huán)境。

鐵死亡與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，免疫細(xì)胞浸潤，化療耐藥性等生物特性有關(guān)。有大量研究指出，多種抗癌藥物除了具有傳統(tǒng)的抑癌作用外，還可以通過加速細(xì)胞的鐵死亡從而達(dá)到更高的抑制作用。比如，雄黃激活鐵死亡通路抑制食管癌的進(jìn)一步發(fā)展[12]，同樣的還有冬凌草甲素[13]，五氨基酮戊酸[14]等，由于鐵死亡通路復(fù)雜，故涉及眾多基因的調(diào)控，因此，針對鐵死亡通路上的靶點設(shè)計及研發(fā)靶點藥物的選擇也更多。

本研究從鐵死亡的角度出發(fā)，通過生物信息學(xué)分析確定了ESCC 中差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因，即RRM2 和KIF20A。結(jié)合分子功能以及在鐵死亡通路中的作用，確定KIF20A 為研究的目的基因。以往的腫瘤研究中KIF20A 的功能研究以促進(jìn)癌細(xì)胞有絲分裂和增殖能力為主，如卵巢癌[15]和肝癌[16]等研究中，KIF20A 被提及為促進(jìn)癌癥驅(qū)動的分子。隨著鐵死亡機制研究的深入，KIF20A 以間接的形式抑制細(xì)胞鐵死亡的功能揭示[5]，因此本研究結(jié)合KIF20A 的以上2 個功能，在食管癌Eca109 細(xì)胞中進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞惡性表型以及鐵死亡方面的研究。

為了驗證KIF20A 對Eca109 細(xì)胞增殖，侵襲遷移能力的影響，在細(xì)胞水平對KIF20A 進(jìn)行了敲低及過表達(dá)處理，結(jié)果顯示，KIF20A 對Eca109細(xì)胞的增殖，侵襲遷移能力起正向促進(jìn)作用。為了探究KIF20A 在ESCC 細(xì)胞鐵死亡中的作用，通過敲低/過表達(dá)KIF20A 后建立鐵死亡應(yīng)激模型，結(jié)果顯示KIF20A 的表達(dá)下調(diào)使Eca109 細(xì)胞對RSL3 誘導(dǎo)的鐵死亡更加敏感，MDA 含量增加，GSH 含量降低，說明KIF20A 敲低引發(fā)較高水平的鐵死亡，而KIF20A 過表達(dá)組結(jié)果與之相反。以上結(jié)果與KIF20A 的鐵死亡抑制功能相符，因此筆者認(rèn)為ESCC 組織中高表達(dá)的KIF20A 可能通過抑制鐵死亡的方式給予ESCC 細(xì)胞更多的生長空間，并且協(xié)助增強ESCC 細(xì)胞的增殖，侵襲遷移能力，有望成為ESCC 患者潛在的干擾及藥物研發(fā)靶點。本研究結(jié)果屬于初步探究KIF20A對ESCC 細(xì)胞生物學(xué)行為及鐵死亡表型的影響，具體分子機制還需進(jìn)一步探索及驗證。