HMGB1基因敲除通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷

張志斌,李瑞彤,鄭衛(wèi)偉,林雪容,牛寧寧,王 慧,苑 萌,韓樹池,薛乾隆

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而引起危及生命的器官功能障礙,肺臟是膿毒癥進(jìn)程中受累的首位靶器官,急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要原因之一。膿毒癥ALI的病理生理機(jī)制復(fù)雜,包括炎癥因子失控性釋放、氧化應(yīng)激反應(yīng)激活等。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box B1,HMGB1)是一種存在于炎癥反應(yīng)晚期的炎癥介質(zhì),其來源包括細(xì)胞主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放,能夠激活Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)、促進(jìn)下游核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)核轉(zhuǎn)位并一方面使炎癥反應(yīng)持續(xù)活化,另一方面促進(jìn)自由基生成、引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[1-2]。相關(guān)的臨床研究[3]結(jié)果顯示,膿毒癥患者血清HMGB1含量增加且與肺臟、腎臟等臟器損傷相關(guān);相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4-5]結(jié)果顯示,多種藥物減輕膿毒癥ALI的治療作用與抑制HMGB1表達(dá)有關(guān)。但HMGB1在膿毒癥ALI發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制尚不完全明確。該研究將通過基因敲除(knock out,KO)的手段分析HMGB1基因減輕膿毒癥ALI及抑制TLR4/NF-κB通路的作用,為深入認(rèn)識HMGB1在膿毒癥ALI發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用及可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型(wild type,WT)SPF級雄性C57BL/6J小鼠24只及HMGB1 KO雄性小鼠24只,體質(zhì)量18～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)過程遵循3R原則。

1.1.2試劑 RIIPA裂解液、核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司),HMGB1、TLR4、NF-κB p65抗體(美國Abcam公司),腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyd,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒(南京建成生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及建模 WT C57BL/6J小鼠分為WT-Sham組和WT-模型組,HMGB1 KO小鼠分為KO-Sham組和KO-模型組,每組12只。WT-模型組和KO-模型組采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥ALI模型,方法如下：造模前禁食12 h、自由飲水,腹腔注射1%戊巴比妥鈉 50 mg/kg麻醉小鼠,擺放仰臥位并做長度2 cm的腹正中切口,分離盲腸并輕輕擠壓盲腸近端糞便,使盲腸末充盈,在盲瓣與盲腸中點(diǎn)用無菌4號線結(jié)扎,在結(jié)扎部位與盲腸頂端中點(diǎn)用21G針頭穿刺盲腸壁,將少許腸內(nèi)容物輕輕擠出并保證穿孔處通暢,然后將擠出的內(nèi)容物擦凈,將盲腸還納腹腔,最后關(guān)閉腹腔、縫合切口、完成造模。Sham組進(jìn)行假手術(shù)操作如下：造模前禁食12 h、自由飲水,按照膿毒癥ALI造模相同的方法麻醉及分離盲腸,在盲瓣與盲腸中點(diǎn)穿無菌4號線,但不進(jìn)行結(jié)扎和穿孔操作,而后將盲腸還納腹腔,最后關(guān)閉腹腔、縫合切口。

1.2.2血?dú)夥治?造模后24 h,腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉小鼠,再次做2 cm的腹正中切口,在小腸后方分離腹主動(dòng)脈,用1 ml注射器在腹主動(dòng)脈處抽取0.7 ml動(dòng)脈血,采用i-STAT型血?dú)夥治鰞x(美國Abbott)進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?檢測動(dòng)脈血氧分壓(partial pressure of arterial oxygen,PaO2),計(jì)算氧合指數(shù)(oxygenation index,OI)=PaO2÷FiO2。

1.2.3血清炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 造模后24 h,腹主動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治龊笫Ｓ嗟臉颖驹? ℃、3 000 r/min、半徑10 cm條件下離心10 min,分離血清并采用試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ROS、SOD的濃度。

1.2.4肺組織病理改變檢測 造模后24 h,取各組小鼠的左肺組織適量,經(jīng)生理鹽水清洗后用4%多聚甲醛固定,制作組織蠟塊后切片,采用HE染色試劑盒對組織切片進(jìn)行染色后在顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。采用半定量評分系統(tǒng)對肺病理改變進(jìn)行評分,包括炎癥、水腫、出血和肺泡間隔增厚4個(gè)項(xiàng)目,每項(xiàng)0～4分,合計(jì)評分即為肺損傷評分。

1.2.5肺組織濕重(W)/干重(D)比值測量 造模后24 h,取各組小鼠的右肺組織,稱量濕重后將組織放入烘箱中,烘干至恒重后記錄干重,而后計(jì)算W/D。

1.2.6肺組織中炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 造模后24 h,取各組小鼠的左肺組織適量,剪碎后加入RIPA裂解液,加入放射免疫沉淀試驗(yàn)(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液勻漿后按照轉(zhuǎn)速12 000 r/min、半徑10 min、溫度4 ℃離心10 min,取上清液,采用BCA法檢測勻漿液的蛋白含量,采用試劑盒檢測勻漿液中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ROS、SOD含量,計(jì)算每毫克勻漿液蛋白中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ROS、SOD的濃度。

1.2.7肺組織中蛋白表達(dá)的檢測 取1.2.5中的勻漿液進(jìn)行HMGB1、TLR4表達(dá)的檢測;另取各組小鼠的左肺組織適量,剪碎后采用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白,進(jìn)行核NF-κB表達(dá)的檢測。檢測時(shí),將30 μg蛋白樣本加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,而后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h,4 ℃下孵育HMGB1一抗(1 ∶500)、TLR4一抗(1 ∶1 000)、NF-κB一抗(1 ∶400)或β-actin一抗(1 ∶5 000)、LaminB一抗(1 ∶3 000)過夜。次日,洗膜3次后室溫下孵育二抗(1 ∶2 000)1 h,最后在凝膠成像儀中進(jìn)行化學(xué)顯影,得到蛋白條帶及對應(yīng)的灰度值,以HMGB1/β-actin、TLR4/β-actin、NF-κB/LaminB的比值作為蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠肺組織中HMGB1表達(dá)的比較WT-模型組小鼠肺組織中HMGB1的表達(dá)水平高于WT-Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KO-Sham組和KO-模型組小鼠肺組織中不表達(dá)HMGB1。見圖1。

圖1 4組小鼠肺組織中HMGB1表達(dá)的比較

2.2 4組小鼠肺損傷程度的比較WT-模型組小鼠PaO2、OI水平低于WT-Sham組,肺損傷評分、W/D比值高于WT-Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);KO-Sham組小鼠PaO2、OI水平及肺損傷評分、W/D比值與WT-Sham組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;KO-模型組小鼠PaO2、OI水平高于WT-模型組,肺損傷評分、W/D比值低于WT-模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 4組小鼠肺損傷程度的比較

2.3 4組小鼠炎癥反應(yīng)程度的比較WT-模型組小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度高于WT-Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);KO-Sham組小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度與WT-Sham組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;KO-模型組小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度低于WT-模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組小鼠炎癥反應(yīng)程度的比較

2.4 4組小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的比較WT-模型組小鼠血清及肺組織中MDA、ROS的濃度高于WT-Sham組,SOD的濃度低于WT-Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);KO-Sham組小鼠血清及肺組織中MDA、ROS、SOD的濃度與WT-Sham組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);KO-模型組小鼠血清及肺組織中MDA、ROS的濃度低于WT-模型組,SOD的濃度高于WT-模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組小鼠炎癥反應(yīng)程度的比較

2.5 4組小鼠TLR4/NF-κB通路的比較WT-模型組小鼠肺組織中TLR4、核NF-κB p65的表達(dá)水平高于WT-Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);KO-Sham組小鼠肺組織中TLR4、核NF-κB p65的表達(dá)水平與WT-Sham組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;KO-模型組小鼠肺組織中TLR4、核NF-κB p65的表達(dá)水平低于WT-模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 4組小鼠TLR4/NF-κB通路的比較

3 討論

炎癥細(xì)胞因子失控性釋放與膿毒癥ALI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。HMGB1是重要的炎癥介質(zhì),炎癥反應(yīng)激活過程中HMGB1的來源包括細(xì)胞主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放,前者指單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等受到感染、缺血缺氧等刺激時(shí)主動(dòng)合成和釋放HMGB1,后者指組織細(xì)胞損傷后發(fā)生破裂、死亡并導(dǎo)致HMGB1被動(dòng)釋放。本研究中,膿毒癥ALI小鼠肺組織中HMGB1表達(dá)增加。以上結(jié)果提示HMGB1高表達(dá)可能參與膿毒癥ALI的發(fā)生發(fā)展,但膿毒癥ALI中HMGB1的生物學(xué)作用尚缺乏直接的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究采用基因敲除的手段對膿毒癥ALI模型中HMGB1的生物學(xué)作用展開分析。野生型小鼠進(jìn)行膿毒癥ALI建模后PaO2及OI降低,肺組織出現(xiàn)間質(zhì)充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤等典型的ALI病理表現(xiàn)且肺損傷評分增加,表明膿毒癥ALI模型制備成功。HMGB1在膿毒癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮促炎作用,促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等向肺組織聚集,進(jìn)而使炎癥反應(yīng)持續(xù)激活、肺損傷加劇[6-7]。本研究使用HMGB1敲除小鼠進(jìn)行膿毒癥ALI建模,敲除HMGB1使PaO2及OI增加,肺組織中間質(zhì)充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤的病理改變減輕且肺損傷評分降低,這一結(jié)果為HMGB1參與膿毒癥ALI提供了直接證據(jù)。

HMGB1促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤的效應(yīng)不僅能夠使TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子大量釋放,炎癥反應(yīng)持續(xù)激活,還能使ROS生成增多,引起組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷,增加脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的生成及抗氧化酶SOD的消耗[8-9]。膿毒癥ALI相關(guān)的基礎(chǔ)研究證實(shí)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)是與肺損傷密切相關(guān)的兩種生物學(xué)因素,多種抗炎、抗氧化治療手段顯著減輕膿毒癥ALI[10-12]。本研究中,野生型膿毒癥ALI小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS、MDA的濃度均增加,SOD的濃度降低,符合膿毒癥ALI發(fā)生發(fā)展中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激過度激活的特征。HMGB1敲除使膿毒癥ALI小鼠的血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS、MDA濃度降低,SOD濃度增加,表明HMGB1在膿毒癥ALI中起到促進(jìn)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的作用,敲除HMGB1使炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激減輕。

HMGB1促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤,調(diào)控炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的機(jī)制可能與激活TLR4/NF-κB 通路有關(guān)。主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放的HMGB1通過TLR4使NF-κB入核,進(jìn)而啟動(dòng)多種炎癥因子表達(dá),導(dǎo)致“炎癥瀑布”[13-14]。已有研究報(bào)道,膿毒癥模型中TLR4及核NF-κB表達(dá)增加與肺損傷、腎損傷等臟器功能障礙相關(guān)[15]。本研究中,野生型膿毒癥小鼠肺組織中TLR4及核NF-κB表達(dá)增加,與既往研究中TLR4/NF-κB 通路參與膿毒癥ALI的結(jié)果吻合。HMGB1敲除使膿毒癥ALI小鼠肺組織中TLR4及核NF-κB表達(dá)降低,表明膿毒癥ALI中HMGB1調(diào)控TLR4/NF-κB 通路,敲除HMGB1使TLR4/NF-κB 通路受抑制,減少NF-κB入核,進(jìn)而抑制NF-κB對多種炎癥因子表達(dá)的促進(jìn)作用,最終實(shí)現(xiàn)減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的效應(yīng)。關(guān)于HMGB1調(diào)控TLR4的機(jī)制,可能涉及轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子調(diào)控與轉(zhuǎn)錄后水平的非編碼RNA調(diào)控,仍需今后設(shè)計(jì)相關(guān)的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行探索。

綜上所述,HMGB1參與膿毒癥ALI的發(fā)生發(fā)展,敲除HMGB1減輕膿毒癥小鼠ALI,與之相關(guān)的分子機(jī)制可能是抑制TLR4/NF-κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。TLR4/NF-κB通路在HMGB1參與膿毒癥ALI發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待今后更多的實(shí)驗(yàn)探索。