肺腺癌中通過靶向CDT1抑制腫瘤生長及其機(jī)制研究

米 源,梁宇翔,王 聰,李德思,宋春濤,蘇 潔,張慶財,王 雷

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因,2018年全世界估計(jì)有210萬新發(fā)肺癌診斷,占全球癌癥負(fù)擔(dān)的12%。在這一年估計(jì)有180萬例病人死于肺癌,占全球癌癥死亡的五分之一[1]。而肺腺癌是最常見的非小細(xì)胞肺癌的病理類型。近幾十年來,隨著分子靶向治療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的發(fā)展在一定程度上提高了肺腺癌患者的生存率。然而,肺腺癌患者5年生存率仍為19%[2]。因此,迫切需要尋找新的靶點(diǎn),以優(yōu)化個性化治療并提高患者生存率。從公共數(shù)據(jù)庫下載肺腺癌患者的基因數(shù)據(jù),通過分析顯示染色質(zhì)許可和DNA復(fù)制因子1(chromatin licensing and DNA replication factor 1,CDT1)是差異基因。CDT1對于DNA復(fù)制的啟動是必不可少的,在細(xì)胞復(fù)制和周期調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了重要作用[3]。近年來,有研究表明CDT1與前列腺癌[4]、急性淋巴細(xì)胞白血病[5]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。然而,CDT1在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展的具體調(diào)控作用及預(yù)后的意義未見明確報道。該文旨在探索CDT1在肺腺癌中的表達(dá)、臨床意義及潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及20對臨床肺腺癌及正常標(biāo)本均由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院保存。CDT1過表達(dá)載體pEGFP-N1-CDT1和對照載體pEGFP-N1(上海,生工生物工程股份有限公司),si-CDT1和對照si-NC(蘇州吉瑪生物科技有限公司),CDT1和GAPDH引物(美國Thermo Fisher),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司),PCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司),CDT1兔抗人單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),TPX2兔抗人多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),p53兔抗人多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),GAPDH鼠抗人單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。EDU試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),Transwell膜嵌套(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1生物信息分析 TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫下載肺腺癌組織及正常組織基因表達(dá),R語言limma包進(jìn)行差異表達(dá)分析,將P<0.05且log2(foldchange)>1作為差異基因的標(biāo)準(zhǔn),R語言ggplot2包進(jìn)行火山圖制作,pheatmap包進(jìn)行熱圖的制作;survival、timeROC包進(jìn)行cox回歸分析及制作ROC曲線,corrplot包進(jìn)行相關(guān)性分析;GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行肺腺癌CDT1表達(dá)的變化。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 肺腺癌A549細(xì)胞系培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM的高糖培養(yǎng)基中,在5%的CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長到90%左右用含0.25%胰蛋白酶EDTA消化液(不含酚紅)消化細(xì)胞,進(jìn)行1 ∶2傳代培養(yǎng)。將呈對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板上,細(xì)胞生長到50%～60%時,更換無血清培養(yǎng)基,并按照LipofectamineTM3000說明書進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染,設(shè)立實(shí)驗(yàn)si-CDT1組和對照si-NC組。24 h提取mRNA,48 h后收集蛋白。

1.2.3實(shí)時熒光定量PCR法檢測基因的表達(dá) 將組織或細(xì)胞用裂解液進(jìn)行裂解,按照RNA提取試劑盒說明書提取各組樣本RNA,測定各組RNA濃度,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。按PCR試劑說明書進(jìn)行基因擴(kuò)增。以GAPDH的Ct值作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) PBS洗滌轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞,用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液收集蛋白,按BCA試劑盒測定總蛋白的濃度。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。冰水浴轉(zhuǎn)到PVDF膜。室溫用含5%脫脂奶粉液封膜進(jìn)行封閉,4 ℃分別加入一抗過夜。次日用TBST洗膜并與二抗孵育1.5 h,最后用ECL試劑來可視化蛋白質(zhì)條帶,用Image軟件檢測蛋白條帶的表達(dá)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及增殖的變化 將轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞用75%乙醇制備成單細(xì)胞懸液,固定6 h以上后用冷PBS漂洗3次,加入碘化吡啶注意避光。上機(jī)檢測周期的變化。收集各組細(xì)胞,按照EDU試劑盒說明書進(jìn)行處理,上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),重懸在無血清培養(yǎng)液中,在上室加入10×104個細(xì)胞的培養(yǎng)液。下室加入含10%血清的培養(yǎng)液600 μl,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后經(jīng)清洗、固定、染色、晾干后在倒置顯微鏡下(×200)視野隨機(jī)選取4個視野,觀察穿膜細(xì)胞數(shù)取平均值。

2 結(jié)果

2.1 CDT1生物信息篩查結(jié)果及組織表達(dá)TCGA數(shù)據(jù)庫下載肺腺癌組織表達(dá)結(jié)果顯示CDT1在肺腺癌中高表達(dá)(圖1A、B);GO分析表明CDT1與細(xì)胞紡錘體組裝相關(guān)(圖1C);GEPIA數(shù)據(jù)庫信息說明在肺腺癌組織中CDT1高表達(dá),課題組也通過PCR檢測臨床20組樣本驗(yàn)證了數(shù)據(jù)庫信息的準(zhǔn)確性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)(圖1D、E)。

圖1 生物信息結(jié)果及CDT1在肺腺癌組織中表達(dá)

2.2 CDT1表達(dá)對肺腺癌預(yù)后的影響對TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析,通過單因素Cox及多因素Cox分析結(jié)果均顯示CDT1的表達(dá)可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(P<0.001)(圖2A、B);通過繪制生存曲線,CDT1與肺腺癌患者的預(yù)后相關(guān)(P=0.032)(圖2C),繪制CDT1表達(dá)水平的ROC曲線,然后計(jì)算了ROC曲線下面積(AUC)。對肺腺癌患者1年、3年、5年生存時間的AUC分別為64.3%、62.8%和57.7%,表明CDT1可能是肺腺癌患者預(yù)后的預(yù)測生物標(biāo)志物(圖2D)。

圖2 CDT1對肺腺癌預(yù)后的分析

2.3 CDT1對免疫治療的預(yù)測作用將CDT1表達(dá)量與免疫監(jiān)測點(diǎn)表達(dá)量進(jìn)行pearson相關(guān)性分析,具體數(shù)值結(jié)果(表1),總體相關(guān)性分析(圖3A);腫瘤突變負(fù)荷(Tumor mutational burden, TMB)已被批準(zhǔn)作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的預(yù)測生物標(biāo)志物,分析CDT1與腫瘤突變負(fù)荷的關(guān)系,結(jié)果表明CDT1的表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷成正相關(guān),表明CDT1的表達(dá)與免疫治療的療效密切相關(guān)(圖3B)。

圖3 CDT1對免疫治療的預(yù)測作用

表1 CDT1表達(dá)量與免疫監(jiān)測點(diǎn)相關(guān)性分析

2.4 敲低CDT1在肺腺癌A549細(xì)胞中的功能變化通過PCR(t=30.36,P<0.000 1)及Western blot(t=8.801,P=0.000 9)驗(yàn)證了si-CDT1可以明顯降低CDT1的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A、B);流式細(xì)胞術(shù)顯示si-CDT1組細(xì)胞增殖能力明顯降低(t=6.093,P=0.003 7)(圖4C);流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期顯示si-CDT1組G0/G1期明顯升高(t=11.72,P=0.000 3),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4D);Transwll實(shí)驗(yàn)顯示CDT1組細(xì)胞侵襲能力明顯降低(t=11.52,P=0.000 3),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4E)。

圖4 沉默CDT1抑制A549細(xì)胞的增殖、侵襲

2.5 敲低、過表達(dá)CDT1后p53、TPX2的表達(dá)變化敲低CDT1后p53(t=3.434,P=0.026 4)表達(dá)相對于對照組表達(dá)明顯升高,TPX2(t=12.35,P=0.000 2)表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;過表達(dá)CDT1后p53(t=3.758,P=0.019 8)表達(dá)明顯降低,TPX2(t=6.944,P=0.002 3)表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖5 敲低、過表達(dá)CDT1后p53、TPX2的表達(dá)變化

3 討論

肺癌是全球癌癥死亡的主要死因,2020年全球有2 206 771例新發(fā)肺癌病例和 1 796 144例死亡病例[6],而肺腺癌又是其主要亞型。盡管近幾十年來免疫治療、放療和手術(shù)切除等多模式治療策略取得了長足進(jìn)步,但治愈肺癌的結(jié)果仍不盡如人意,其5年生存率不到20%[6]。因此,迫切需要有效的肺腺癌生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。

有研究[7]表明CDT1與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān),但在肺腺癌中作用機(jī)制及預(yù)后未見明確報道。本研究中,數(shù)據(jù)庫信息及臨床樣本顯示CDT1在肺腺癌組織中高表達(dá),因此CDT1有望作為肺腺癌治療新的靶點(diǎn)。

TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明CDT1可作為預(yù)測肺腺癌的預(yù)后指標(biāo),高表達(dá)的CDT1患者與低存活率有關(guān)。并且1年內(nèi)準(zhǔn)確性是更高的。并且近年來,針對免疫檢查點(diǎn)的免疫療法的臨床應(yīng)用提高了臨床療效,改變了肺腺癌的治療范式[8]。因此課題組將CDT1的表達(dá)與免疫監(jiān)測點(diǎn)表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性分析,在這些分子中與CD276正相關(guān)最大, CD276是一種共刺激/共抑制分子,作為一種共刺激分子,CD276信號誘導(dǎo)細(xì)胞免疫及增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生成,而作為一種共抑制分子可以抑制Treg細(xì)胞,從而誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸反應(yīng)[9]。

最后本研究將CDT1的表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷(Tumor mutational burden, TMB)進(jìn)行了相關(guān)性分析, TMB是指腫瘤細(xì)胞中體細(xì)胞突變的總負(fù)荷。高TMB患者可能對免疫治療有反應(yīng)。TMB已被開發(fā)作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的一種預(yù)測性生物標(biāo)志物[10]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CDT1表達(dá)與TMB成正相關(guān)。綜上結(jié)果表明CDT1的表達(dá)與肺腺癌的免疫治療存在密切的關(guān)系。

隨后CDT1對腫瘤細(xì)胞功能的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過siRNA敲低CDT1基因后,發(fā)現(xiàn)肺腺癌增殖能力下降,G0/G1期細(xì)胞明顯增加。這與Cai et al[3]在前列腺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)敲低CDT1抑制腫瘤的增殖及改變細(xì)胞周期的結(jié)果是相一致的。侵襲和轉(zhuǎn)移的激活是癌癥的主要特征之一[11]。又通過Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了敲低CDT1后細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降。Maimaiti et al[12]在乳腺癌中同樣發(fā)現(xiàn)影響CDT1可以改變腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力,本文結(jié)果與之一致。

接下來本研究進(jìn)一步對CDT1可能影響腫瘤的通路進(jìn)行了驗(yàn)證。首先通過腫瘤蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDT1與非洲爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2(TPX2)關(guān)系密切。TPX2是有絲分裂紡錘體功能所需的微管相關(guān)蛋白,不僅在細(xì)胞周期中起作用,還參與腫瘤轉(zhuǎn)移、凋亡等過程[13],同時Chen et al[14]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中靶向TPX2可以通過激活p53抑制腫瘤的增殖。Western blot顯示敲低CDT1后,TPX2表達(dá)降低、p53表達(dá)增加,而過表達(dá)CDT1后相應(yīng)蛋白的表達(dá)發(fā)生了相反的變化。綜上結(jié)果表明敲低CDT1可能通過影響TPX2促進(jìn)p53的表達(dá)達(dá)到抗腫瘤的結(jié)果。

本研究揭示了CDT1在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中的潛在意義和可能機(jī)制,但仍存在一定的局限性。首先,CDT的功能評估尚缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。其次, CDT1的表達(dá)與預(yù)后意義需要多中心的臨床樣本去驗(yàn)證。最后,盡管這項(xiàng)研究表明CDT1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和影響免疫治療的機(jī)體分子機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

綜上所述,本研全面系統(tǒng)地評價了CDT1在肺腺癌的發(fā)展及預(yù)后的影響。為肺腺癌的治療確定了新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。