基于網絡藥理學和體內實驗分析黃柏多糖治療肝損傷的作用機制

薛 娟,楊 欣,莫共柔,劉龍江,陳 彪,柴慧芳

肝臟作為人體重要的代謝和解毒器官,會受到各種因素的損害,如長期酗酒、病毒感染、藥物毒性、代謝紊亂、不良情緒和免疫反應等。然而目前肝損傷的臨床治療效果不佳,病死率較高[1]。因此,探索有效的防治肝損傷的藥物具有重要的意義。中醫藥以其多成分、多靶點的優勢在防治肝損傷方面展示了廣闊的開發前景。黃柏為蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronamurenseSchneid.)的干燥樹皮,味苦、性寒,歸腎、膀胱經,具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之效,收載于《中國藥典》[2],2021年入選貴州省道地藥材目錄(第一批)?，F代研究[3-5]表明黃柏含有生物堿、酚酸、檸檬苦素、多糖等成分,具有抗菌、保肝、抗潰瘍、抗氧化、抗痛風等多種藥理活性[6-8]。與其他中藥一樣,黃柏化學成分復雜、作用靶點多,其保護肝臟作用的機制研究較少,有待深入探討。該研究利用網絡藥理學結合小鼠免疫肝損傷實驗模型,深入探討黃柏提取物對肝損傷的保護作用及機制,為充分利用黃柏豐富的天然植物資源提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器 黃柏藥材購于貴州苗立克中藥科技有限公司,批號：171101,生產許可證：黔20160079。刀豆蛋白A(Con A,貨號：824V032)購于北京索萊寶科技有限公司;過氧化氫酶(catalase,CAT,貨號：20211116)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,貨號：20211213)、丙二醛(malondialdehyde,MDA,貨號：20211118)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,貨號：Dec 2021)、白細胞介素(intreleukin,IL)-6、IL-1β、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)購于上海茁彩生物科技有限公司(貨號均為Dec 2021);酶標分析儀購于北京普朗新技術有限公司,分析天平購于上海市卓精電子科技有限公司。

1.1.2實驗動物 60只雄性BALB/c小鼠,5～6周齡,18～22 g,均購于長沙市天勤生物技術有限公司,許可證號：SCXK(湘)：2019-0014。

1.2 方法

1.2.1黃柏活性成分篩選和靶點預測 借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,https：//tcmspw.com),以“黃柏”為檢索詞,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為設定條件,篩選黃柏潛在的活性化學成分。將化學成分輸入Pubchem (https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov /)數據庫中下載“SDF”格式的分子結構,然后上傳至Swiss target prediction平臺(http：//www.swisstar getprediction.ch/)篩選藥物作用靶點。

1.2.2疾病靶點篩選 以“liver injury”為關鍵詞在GeneCards(http：//www.genecards.org/)、OMIM數據庫(http：//www.omim.org)數據庫檢索疾病靶點,將兩個數據庫靶點信息進行合并去重,獲得肝損傷相關靶點。將黃柏活性成分靶點和疾病靶點導入FunRich 3.1.3軟件取交集,最終獲得黃柏治療肝損傷的潛在作用靶點。

1.2.3蛋白相互作用 將獲取的交集靶點導入STRING(https： //cn.string-db.org/)網站,得到蛋白互作網絡(PPI)和TSV文件,再用R軟件對TSV文件的靶點數據行統計和繪圖分析。

1.2.4GO功能及KEGG通路富集分析 利用R軟件對潛在作用靶點進行京都基因(geneontology, GO和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and gnomes, KEGG)通路分析。GO分析包括生物學過程(biological process, BP),細胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF) 3個方面。GO和KEGG均選取排名前10名結果,繪制氣泡圖。

1.2.5分子對接 37個活性化合物從PubChem數據庫下載3D結構的sdf文件并進行能量優化,再從PDB網站下載蛋白互作網絡(protein protein interaction network,PPI)關聯度最高的5個蛋白的蛋白質結構,存為pdb文件,后將其導入SYBYL 2.1.1軟件中進行預處理,包括提取配體小分子、去除水分子、加氫等。最后利用SYBYL 2.1.1將對應的化合物與蛋白進行分子對接,利用打分函數進行評價。

1.2.6動物實驗

1.2.6.1分組、給藥及模型建立 雄性BALB/c小鼠,隨機分成6組,每組10只：空白組、模型組、陽性藥物組及黃柏多糖高、中、低劑量組?？瞻捉M和模型組以等體積生理鹽水進行灌胃,陽性藥物組以聯苯雙酯滴丸200 mg/kg的劑量進行灌胃,黃柏多糖高、中、低劑量組分別以黃柏多糖686.4、343.2、171.4 mg/kg進行灌胃(劑量依據《中國藥典》中黃柏人用劑量經人/小鼠等效劑量折算后設置),每日灌胃1次,連續灌胃14 d。末次灌胃1 h后,空白組尾靜脈注射生理鹽水10 ml/kg,其余5組靜脈注射Con A 15 mg/kg造模。禁食禁水6 h,小鼠眼球取血,室溫靜止后離心,血清-80 ℃保存;隨后立即脫臼處死小鼠,摘取的肝臟部分于-80 ℃冰箱保存,部分常溫保存,用4%多聚甲醛固定。

1.2.6.2肝組織病理觀察 部分肝組織用4%多聚甲醛后,石蠟包埋切片,將切片入二甲苯,水化,蘇木精-伊紅(HE)染色,在光學顯微鏡下進行病理形態檢查。

1.2.6.3小鼠血清中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平檢測 小鼠血清按照試劑盒說明書檢測ALP、AST水平。

1.2.6.4肝臟中SOD、CAT、MDA水平檢測 取肝組織適量,生理鹽水配成勻漿液,15 000 r/min離心10 min,取上清液,用BCA法測肝組織蛋白濃度,按照試劑盒說明書測定MDA、CAT水平與SOD活性。

1.2.6.5血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1炎癥因子含量的測定 采用ELISA法,嚴格按照試劑盒說明檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1含量。

1.2.6.6qRT-PCR檢測肝組織TNF-α mRNA表達 取肝臟組織提取RNA,逆轉錄為cDNA,以β-actin作為內參照,采用2-ΔΔCt法計算TNF-α基因mRNA表達水平。TNF-α上游引物：5′-GAGACAGATGTGGGGTGTGA-3′,下游引物5′-GTCACTCGGGGTTCGAGAAG-3′。

1.3 統計學處理數據統計分析采用SPSS 21.0軟件,組間比較用單因素方差分析,LSD-t檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃柏活性成分靶點及疾病靶基因篩選結果最終獲得37個黃柏化學成分,見表1。37個成分經Swiss target prediction平臺預測獲得467個靶點蛋白。基于GeneCards、OMIM數據庫檢索,整理得到2 607 個疾病靶點;將上述黃柏靶點蛋白與疾病靶點取交集并繪制Venn圖,得到核心靶點346個,見圖1。

圖1 中藥黃柏與肝損傷交互靶點信息

表1 黃柏活性成分信息

2.2 蛋白相互作用346個靶點使用STRING進行PPI分析,利用R語言繪制蛋白質節點的條形圖,見圖2。Degree排名前5的節點包括TNF-α,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine-protein kinase 1,AKT1),信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3),表皮生長因子受體(pidermal growth factor receptor,EGFR)和半胱天蛋白酶3(caspase-3,CASP3)。

圖2 PPI網絡核心基因條形圖

2.3 GO功能及KEGG通路富集分析使用R語言完成346個靶點的GO富集分析,輸出前10項,見圖3(A～C)。結果顯示346個靶點參與的生物過程中主要富集于MAPK級聯反應的正向調控、激酶活性的正向調節、對異種刺激的反應、氧化應激反應等;細胞組分主要涉及膜筏、膜微域、神經元細胞體、焦點粘連等;分子功能主要為蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和RNA聚合酶II-特異性DNA-結合轉錄因子結合等。

圖3 GO功能和KEGG通路富集分析氣泡圖

346個靶點涉及的信號通路同樣基于R語言輸出前10項,見圖3D。主要涉及PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、癌癥中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)等。

2.4 分子對接基于SYBYL 2.1.1分子對接驗證黃柏37個化學成分與5個關鍵靶點的結合情況,對接結果以打分函數T_score≥5為閾值,T_score≥5表示活性成分與靶標蛋白有較好的結合,分子對接結果見表2。37個成分中,22個成分能與AKT1有較好的結合,21個成分能與CASP3、TNF-α有較好的結合,17個成分能與STAT3、EGFR有較好的結合。37個成分中,9個化學成分能同時與5個靶點(TNF-α、AKT1、STAT3、EGFR、CASP3)有較好的結合(T_score≥5,圖4),分別是Hericenone H、delta 7-stigmastenol、campesterol、Candletoxin A、beta-sitosterol、quercetin、phellamurin_qt、poriferast-5-en-3beta-ol、niloticin,它們可能是黃柏治療肝損傷的關鍵成分,后續將進一步深入研究。

圖4 分子對接熱圖

表2 分子對接分析

2.5 動物實驗結果

2.5.1小鼠肝組織病理變化 各組小鼠肝組織HE染色結果如圖5所示?？瞻捉M肝臟組織結構正常,肝細胞排列整齊、分布均勻,細胞核完整,無炎癥顆粒細胞浸潤。模型組肝臟組織結構明顯異常,肝細胞已經紊亂,細胞核固縮,且有炎性顆粒細胞浸潤。與模型組相比,陽性對照組和黃柏多糖高劑量組肝臟組織細胞結構顯著改善,炎性顆粒細胞明顯減少,黃柏多糖中、低劑量組也有一定改善。

圖5 黃柏多糖對Con A誘導肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 HE ×100

2.5.2小鼠肝功能指標AST、ALP的檢測 與空白組相比,模型組小鼠血清AST、ALP水平顯著升高(P<0.01),說明尾靜脈注射Con A對小鼠肝組織造成了嚴重損傷。各給藥組小鼠的ALP、AST水平與模型組相比,均下降,其中黃柏多糖高劑量組有顯著差異(P<0.01),黃柏多糖中劑量組有差異(P<0.05),見表3。

表3 黃柏多糖對小鼠血清AST、ALP的影響

2.5.3肝臟中SOD、CAT、MDA的水平檢測 與空白組對比,模型組小鼠肝臟中的SOD、CAT含量顯著下降(P<0.01),MDA含量顯著升高(P<0.01)。黃柏多糖干預后,SOD、CAT含量均有所升高,MDA含量有所降低,其中高劑量組變化最顯著(P<0.01),中劑量組次之(P<0.05),低劑量組最弱,見圖6。

圖6 黃柏多糖對肝損傷小鼠血清SOD、CAT、MDA的影響

2.5.4血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1免疫炎癥因子含量的測定 各組對Con A誘導肝損傷小鼠血清炎癥因子的影響結果見圖7。與空白組比較,模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)。給予黃柏多糖后,各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1均有一定程度的降低,其中高劑量組變化最顯著(P<0.01),中劑量組次之(P<0.05或0.01),低劑量組各因子也有所降低,但差異無統計學意義。

圖7 黃柏多糖對肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1細胞因子的影響

2.5.5qRT-PCR檢測肝組織TNF-α mRNA表達 選取PPI網絡中最重要的TNF-α基因進行實驗驗證。與空白組比較,模型組小鼠肝組織中TNF-α mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,黃柏多糖高、中劑量組TNF-α mRNA水平顯著降低(P<0.01或0.05),黃柏多糖低劑量組也有所降低,見圖8。

圖8 黃柏多糖對肝損傷小鼠肝臟TNF-α mRNA表達的影響

3 討論

中藥是中華文明的瑰寶,在防治肝病方面有著悠久的用藥歷史,因此,以中藥為著眼點,開發其藥用價值并探討作用機制有一定的創新性。網絡藥理學的出現為預測中藥成分靶標和疾病基因提供了新的手段,它從整體角度探索藥物與疾病的關聯性[9]。因此通過網絡藥理學分析和體內實驗驗證黃柏抗肝損傷的作用機制、篩選其活性成分靶點有重要意義。

本研究首先于TCMSP數據庫檢索并篩選得到37個黃柏潛在的活性成分,主要有小檗堿、黃連堿、黃柏酮等多種化合物。研究[10]表明,黃柏提取液對D-氨基半乳糖(D-Gal N)誘導的急性肝損傷有較好的預防性保護作用,其作用機制可能與清除氧自由基,降低脂質過氧化等抗氧化作用有關。黃柏乙醇提取物對α-萘異硫氰酸酯(ANIT)誘導的黃疸型肝炎模型小鼠具有一定的預防及治療作用。同時,對于黃藥子導致的肝中毒,黃芩、黃柏及其配伍使用可顯著降低大鼠血清轉氨酶,其中黃芩配伍黃柏使用效果最佳。這些研究結果均表明黃柏有效成分具有保護肝損傷作用,然而,藥效物質基礎及作用分子機制尚不明確。

對黃柏與肝損傷疾病交集靶點進行PPI分析,結果顯示TNF-α、AKT1、STAT3、EGFR和CASP3是5個度值最大的靶點。TNF-α可促白細胞活化、聚集、黏附,也可促血小板活化,加重組織炎癥反應,致肝損傷[9]。AKT1參與細胞增殖、細胞生長、代謝、氧化應激、炎癥等方面相關的信號通路[11]。STAT3廣泛分布于各個器官,參與各胚層發育、免疫細胞分化發育、腫瘤等各種病理生理過程,是調節細胞增殖、分化、存活,以及自身免疫和炎癥的關鍵因子,EGFR在控制炎癥方面具有關鍵作用;經過上述分析,5個核心靶點主要與炎癥、細胞凋亡、氧化應激和免疫反應等密切相關。

GO分析顯示,黃柏活性成分治療肝損傷涉及MAPK級聯反應的正向調控、激酶活性的正向調節、對異種刺激的反應、氧化應激反應等,KEGG分析結果表明,黃柏可能通過PI3K-Akt信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、乙型肝炎等通路發揮對肝臟的保護作用。其中,脂質和動脈粥樣硬化通路可能是肝損傷發生發展的重要環節,KEGG分析顯示TNF-α、AKT1、CASP3、STAT3等多個靶點均富集在該通路上,說明調控該通路可能是黃柏緩解臨床癥狀、保護肝損傷的作用機制。

進一步對黃柏潛在活性成分等與關鍵靶點蛋白進行分子對接,發現大部分活性成分可與靶點蛋白有較好的結合作用,其中Hericenone H、delta 7-stigmastenol、campesterol、Candletoxin A、beta-sitosterol、quercetin、phellamurin_qt、poriferast-5-en-3beta-ol、niloticin 9個成分均可與5個核心靶點TNF-α、AKT1、STAT3、EGFR和CASP3結合,由此推測該9個成分可能是這些靶點蛋白的潛在抑制劑,而這5個靶點亦可能是黃柏治療肝損傷的關鍵靶點。

綜合考慮網絡藥理學以及分子對接結果,進一步進行小鼠體內實驗研究。研究[12]表明,黃柏具有廣譜抗炎和免疫調節活性。如黃柏水提物可通過抑制γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-1、TNF-α等細胞因子的產生和分泌,從而抑制小鼠遲發型超敏反應(delayed type hypersensitivity,DTH)。由Con A引起的肝損傷是國際公認的免疫性肝損傷實驗動物模型,因此本研究選擇Con A建立小鼠肝損傷模型。動物實驗結果顯示,經黃柏多糖治療后,Con A誘導的肝損傷小鼠轉氨酶水平降低,肝臟組織中SOD、CAT水平升高,MDA水平下降,黃柏多糖干預可降低肝損傷小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1水平,明顯逆轉了Con A誘導的肝損傷小鼠肝臟TNF-α mRNA水平的升高。研究表明,測定血清中ALP和AST活性可反映肝細胞損傷的程度;同時,當肝細胞受到損傷后,MDA含量升高,其具有較強毒性,可導致細胞裂解和壞死,破壞蛋白和酶的結構和功能[13-14],同時,作為抗氧化酶的SOD和CAT發揮抗氧化作用,從而防止肝細胞損傷[15]。以上結果表明黃柏多糖保護肝損傷作用可能與降低體內氧化應激及調控炎癥因子水平有關。

綜上所述,黃柏提取物可以改善Con A誘導的小鼠免疫性肝損傷,其機制可能通過抑制氧化應激和炎癥反應來實現。本研究為黃柏治療肝損傷奠定了一定的研究基礎,但仍需細胞實驗進行進一步驗證。