2020-2022年海南省諾如病毒胃腸炎暴發疫情分子流行特征分析

曾云婷,陳海云,李丹丹,楊艷輝,靳 淼,黃 瓊,崔 蕾,潘正帆,任莉娜,遇曉杰

NoV是引起世界人AGE暴發流行的最重要病原,感染所有年齡組[2-3]。據估計,NoV感染占全球AGE病例的18%;所有胃腸炎暴發中,50%由諾如病毒引起[4]。該研究首次對海南地區開展2020至2022年AGE暴發NoV的3年連續監測并確定其分子流行特征,為海南省NoV暴發的預防和控制提供科學依據并完善數據資料,為下一步開展海南省病毒性腹瀉網絡監測工作打下基礎。

1 材料與方法

1.1 海南省胃腸炎暴發監測《諾如病毒感染暴發調查和預防控制技術指南(2015版)》指出,NoV暴發定義為3 d內同一場所發生3例及以上急性胃腸炎病例,其中至少2例NoV實驗室診斷病例;AGE定義為24 h內出現3次及以上大便和/或2次嘔吐。2020年1月至2022年12月,海南省疾控中心收到8個市/縣疾控中心(定安縣、文昌市、澄邁縣、臨高縣、白沙縣、樂東縣、東方市和萬寧市)報送的胃腸炎暴發中采集的肛拭子標本及相關流行病學、臨床信息。海南省疾病預防控制中心對標本進行NoV檢測和基因分型。

1.2 病毒核糖核酸的提取肛拭子樣品加入2 ml磷酸緩沖液,旋渦振蕩混勻,取200 μl上清液,使用西安天隆qEx-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒進行初篩,用羅氏公司提供的High Pure Viral RNA Kit進行待測序樣品的提取核酸。

1.3 NoV檢測和分型采用實時熒光諾如病毒檢測試劑盒(江蘇碩世生物科技股份有限公司)對樣本進行分型檢測,選擇CT值≤30的陽性樣本用另一實時熒光諾如檢測試劑盒(深圳生科原生物有限公司)進行復檢,以備擴增測序待用。待測序樣本采用分型 RT-PCR 擴增,對聚合酶(ORF1)和衣殼區(ORF2)基因片段同時進行分型,使用一步法RT-PCR試劑盒OneStep RT-PCR kit(德國凱杰公司,貨號210212),引物MON432和G1SKR對GI組NoV分型,MON431和G2SKR對GII組NoV分型(ref)。反應條件：42 ℃、30 min;95 ℃、15 min;40個循環包括95 ℃、1 min、50 ℃、1 min和72 ℃、1 min;72 ℃、10 min。

1.4 基因組擴增real-time RT-PCR檢測陽性但CT值高于30以上的樣品因其病毒載量較低測序很難成功等原因,故成功獲得了13起暴發的測序和分型。根據全國流行的情況,GⅡ.2[P16]4株、GⅡ.3[P12]2株和GⅡ.4 Sydney[P31]為主要的流行株,對這3種基因型8株毒株進行擴增,其方法和引物序列如文獻所示[5]。

1.5 測序和序列分析RT-PCR產物送北京天一輝遠生物科技有限公司。使用ABI 3730XL測序。測序結果應用DNAStar V7.10進行序列拼接,應用MEGA 5.0軟件進行比對和系統進化分析。

1.6 關鍵氨基酸位點分析利用MAFFT軟件進行多序列比對對齊;利用MEGA 5.0軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列,并對關鍵位點進行比對分析;利用WebLogo 3工具將關鍵氨基酸位點分析結果可視化,每個氨基酸的字體大小與每個位置的保守百分比成比例。底部數字表示氨基酸位置,以不同顏色表示活性位點(紫色)、預測的抗體結合位點(紅色)和HBGA結合位點(綠色)。氨基酸根據其化學性質而具有顏色：極性氨基酸(G、S、T、Y、C)顯示為綠色,中性(Q、N)顯示為紫色,堿性(K、R、H)顯示為藍色,酸性(D、E)顯示為紅色,疏水性(A、V、L、I、P、W、F、M)氨基酸顯示為黑色。

無論是酯、酸酐還是酰氯，其與有機鋰試劑反應而生成的中間產物是不穩定的，在過程中即可分解為酮，所以在產物中常是酮和3°ROH的混合物。

1.7 統計學處理利用Excel 2019 整理數據、繪制圖表,用Arc GIS軟件進行地圖繪制,采用描述性統計學方法對疫情數據進行分析,計數資料的比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流行病學情況2020-2022年海南省共收集胃腸炎暴發39起,根據real-time RT-PCR檢測結果,按照監測暴發定義來自中國疾控中心發布的《諾如病毒感染暴發調查和預防控制技術指南(2015版)》,確認NoV暴發25起(64.1%,25/39),其中GI、GII、GI/GII混合引起的暴發數分別為3起、21起和1起。NoV暴發數最多出現在2021年2月(4起),其次是2020年7月和9月(各3起)(圖1)。根據場所分布,NoV暴發主要集中在托幼機構和學校(幼兒園15起、小學3起、中學2起),占80.0%;居民區2起,餐點、建筑工地和養老院各1起。根據地理分布(圖2),NoV暴發主要集中在海口周圍縣(東北部),包括定安(5起)、文昌(4起)、澄邁(4起)和臨高(3起);其次集中在中西部,包括白沙(2起)、樂東(2起)和東方(3起);東南部萬寧1起。

圖1 2020-2022年海南省NoV胃腸炎暴發時間分布圖

圖2 2020-2022年海南省NoV胃腸炎爆發地區分布圖

在25起NoV引起的胃腸炎疫情中,共計檢出NoV陽性樣本119例,其中GI 9例、GII 110例,2～6歲NoV陽性76例(含GI 2例),男性構成比65.79%(50/76),女性34.21%(26/76),其陽性構成比男性高于女性,經χ2檢驗,P<0.05;7～17歲陽性14例,男性構成比71.43%(10/14),女性28.57%(4/14),其陽性構成比男性高于女性,經χ2檢驗,P<0.05;18～40歲陽性13例,男性5例(建筑工地),女性8例(其中7例在幼兒園,1例在居民區),與職業有關聯;55歲及以上人群陽性16例(含GI 7例),男性構成比18.75%(3/16),女性71.25%(13/16),其陽性構成比女性高于男性,經χ2檢驗,P<0.05。

2.2 基因型與流行病學特征根據RT-PCR分型及測序,13起諾如病毒暴發獲得分型結果,均為GⅡ組諾如病毒,檢出4種基因型,GⅡ.2[P16]為主要流行株,占60%(9/13),其他3種基因型為GⅡ.4 Sydney[P31](15.4%,2/13)和GⅡ.4 Sydney[P16](7.7%,1/13)和GⅡ.3[P12](7.7%,1/13)。GⅡ.2[P16]集中在2020年8月至2021年2月,9月檢出最多,為3起。GⅡ.4 Sydney[P31]在2021年2月和2022年2月檢出各一起。GⅡ.4 Sydney[P16]和GⅡ.3[P12]分別在2021年6月和2022年3月檢出(圖1)。9起GⅡ.2[P16]引起的暴發中,7起發生在幼兒園,中學和建筑工地各1起;年齡主要集中在2～6歲(14/21),7～17歲3人,18～40歲4人。他基因型引起的暴發均發生在幼兒園,年齡均集中在2～6歲。

2.3 基因組進化分析本研究獲得8株諾如病毒基因組序列,包括GⅡ.2[P16]4株、GⅡ.3[P12]2株和GⅡ.4 Sydney[P31]2株,除2株GⅡ.3[P12]毒株來自同一起暴發外,其他均來自于不同起暴發。

GⅡ.2衣殼區主要分為3個亞群,包括Cluster I(2008～2012)、ClusterⅡ(2016～2012)和ClusterⅢ(2016～2022),本研究4株GⅡ.2[P16](2020年3株和2022年1株)與ClusterⅢ劃分為1個亞群(圖3)。Reemerging GⅡ.P16亞群進一步可以分為4個亞群Cluster I-IV,本研究分離的4株GⅡ2.[P16]在RdRp區與ClusterⅢ劃分為同一亞群(圖4)。

圖3 2020-2022年海南省8株NoV毒株VP1區進化樹

圖4 2020-2022年海南省8株NoV毒株RdRP區進化樹

GII.P31 RdRp區序列主要分為3個群。根據RdRp區系統進化分析,本研究獲得的2株GⅡ.4 Sydney[P31]屬于ClusterⅢ(圖4)。VPI也相應分為3個群(ClusterI-Ⅲ),本研究獲得的2株GII.4 Sydney[P31]屬于ClusterⅢ(圖3)。

GII.3[P12]在衣殼區屬于4個群,包括Cluster I(2008～2012)、Cluster Ⅱ(2015～2016)、ClusterⅢ(2020～2022)和ClusterⅢ(2022),本研究獲得的2株GⅡ.3[P12]屬于Cluster IV(圖3)。GII.3[P12]在聚合酶區分為3個群(Cluster),本研究獲得的2株GII.3[P12]屬于ClusterⅢ(2016-2022)(圖4)。

2.4 基因組氨基酸位點分析

2.4.1GⅡ.3[P12] 本研究分別收集了72條GⅡ.3 VP1和112條GⅡ.P12 RdRp序列進行氨基酸位點變化比較。RdRp區有8個獨特的氨基酸取代,其中氨基酸位點S4A(11.6%)、K76A(43.7%)和V91I(10.7%)取代頻率較高,其他氨基酸均比較保守(圖5A)。VP1區存在27個氨基酸取代。 9個在NS結構區,其中T9A(40.2%)、D30E(40.2%)、V179I(47.2%)和D209G(45.8%)替代頻率較高(圖5B、C);5個在P1區,包括T228S(23.6%)、A476S(22.2%)、T478S(15.2%)、N510S(9.7%)和I547V(45.8%)(圖5B);15個在P2區,其中V289T(22.2%)、A368S(47.2%)、G385D(40.2%)、H404N(26.3%)、A406S(19.4%)和S417A(22.2%)替代頻率較高(圖5C)。

圖5 2020-2022年海南省8株諾如病毒毒株基因點位分析圖

2.4.2GⅡ.2[P16] 本研究收集了91條GⅡ.2VP1序列和112條GⅡ.P16 RdRp序列進行氨基酸位點變異情況分析。結果表明,VP1區,P2亞區的G354A位氨基酸(23%);HBGAs結合位點I附近的V256I(28.5%)、I373 V(8.7%)和N386S(6.5%);抗原表位D附近的T399 V(5.4%)以及N區/S區的A7S1位氨基酸(23%)和N78S(14.2%)替換率較高(圖5D)。GⅡ.P16 RdRp區的氨基酸位點變化趨于保守,變異的位點主要分布在H123T(12.3%)、V125A(14.4%)和A360T(10.1%)(圖5E)。

2.4.3GⅡ.4 Sydeny[P31] 抗原表位分析顯示,GⅡ.4 Sydney[P31]的氨基酸變化主要分布在A表位,分別為H297R(39%)、N372D(45.9%)、N373H(47.1%)。其他表位也存在變化,分別為B表位的M333V(43.6%);D表位的G393S位(29.8%);E表位的P414H(29.8%)和H表位的S309N(39%)(圖5F、G)。GII.4 Sydney[P31]在RdRp區氨基酸趨于保守,變異位點主要有15個,其中V179I(38%)、V274I(30%)和K357R(28.5%)替代率較高(圖5H)。

3 討論

根據先前的研究,我國NoV暴發報告主要集中在東南沿海地區[6]。我國東南沿海地區冬季溫度、相對濕度有助于諾如病毒的流行。其次,報告疫情最多的省份,廣東、浙江、江蘇和福建等省份,其高人口密度,也影響了NoV流行的強度。海南同屬我國沿海省份,本研究填補了海南NoV暴發監測的空白。與北半球其他國家的研究類似,我國NoV暴發的高峰主要發生在10月至次年3月[7]。本研究與先前報道相一致,暴發主要集中10至次年3月。

根據本研究,海南省NoV暴發主要發生在學校和托幼機構,在我國其他地區也觀察到了類似的結果[8]。但在西方國家NoV暴發報告主要來自醫療機構,如長期護理機構和醫院[9]。我國對老年人的護理主要由家庭成員提供,老年人去長期護理機構并不是普遍現象;相反,西方國家長期護理機構很普遍。其次,我國和其他西方國家在監測系統的敏感性和覆蓋面方面存在重大差異。在美國,除長期護理機構外,其他機構的疫情報告沒有法律規定,因此這些機構的疫情報告不足[10]。而我國有完善的學校和托幼機構傳染病報告體系,因此,大部分NoV暴發報告來自學校和托幼機構。相對于其他暴發場所如養老院、醫院、餐館等報告少,可能是由于暴發收集的偏差所致。本研究也報告了來自餐點、建筑工地和養老院等場所,提示這些暴發場所也值得關注。

本研究根據不同年齡組及性別進行NoV陽性構成比的比較,2～17歲年齡段與大于55歲年齡段的陽性構成比存在性別差異,前者男性高于女性,后者女性高于男性,可能不同年齡段不同性別行為特征不同,導致在爆發地點的活動范圍有所差異而引起的陽性構成比存在性別差異,也可能是爆發場所的群體基礎性別存在差異所致。18～40歲年齡段,因爆發場所不同,職業群體存在性別差異,導致NoV陽性檢出率不同,托幼機構職業群體多為女性,建筑工地則多為男性,由于本次研究獲得這一年齡段陽性數據有限,有待于進一步研究論證。

本研究與國內其他報道一致,引起海南省NoV暴發的基因型是4種最為常見的基因型,包括GⅡ.2[P16]、GⅡ.4 Sydney[P31]、GⅡ.4 Sydney[P16]和GⅡ.3[P12]。GⅡ.4基因型自1995年以來,一直是導致全球流行的基因型。GⅡ.4基因型每隔幾年就有新的變異株出現,引起全球新一輪NoV胃腸炎暴發流行。GⅡ.4 Sydney[P31]基因型自 2012 年出現以來一直是全球流行優勢株[11-12]。根據美國NoV暴發監測,2015年至2016年,GⅡ.4 Sydney變異株聚合酶基因型從[P31]轉變為[P16],之后,歐美國家暴發流行優勢株為GⅡ.4 Sydney[P16][5]。而我國處于GⅡ.4 Sydney[P31]和GⅡ.4 Sydney[P16]共流行的狀態,海南與我國其他地區報道一致[13]。GⅡ.4基因型主導全球流行的同時,也出現其他基因型造成區域性流行。在2016年,新的重組株GⅡ.2[P16]基因型在我國和亞洲國家出現并引起暴發急劇增加[14-15],但在歐美國家的暴發中不超過 20%[5]。這可能與種族易感性有關,也可能是因為NoV在中國的暴發多發生在學校,而在北美、歐洲和澳大利亞的暴發多發生在醫療機構,包括老年人的長期護理機構[9]。在本研究中也檢測到了GⅡ.3基因型引起的暴發。GⅡ.3型NoV是檢測到的第二常見基因型,與引起所有年齡段人群AGE的GⅡ.4型NoV不同,GⅡ.3 基因型主要導致5歲以下兒童的AGE,提示可能具有持續的終身保護[16]。

根據基因組進化分析,引起海南NoV暴發的主要流行株GⅡ.[P16]與引起我國16/17年暴發增加的GⅡ.2[P16]仍然同屬一簇,提示GⅡ.2[P16]自16年出現以來,仍然處于主導地位。根據氨基酸變異位點分析, 氨基酸變異變化不大。目前,RdRp區功能研究尚不清楚,還需要更進一步的研究探明不同結構蛋白區域突變的表型,以更好理解它們與傳播性和大流行影響的聯系。

本研究開展的時間正值新冠肺炎疫情流行和防控期間,根據研究報道,非藥物干預措施,限制社交距離和采取個人防護措施都通過減少與病原體的接觸有效遏制了疾病的傳播,如NoV[17]。但有研究預測,若解除接觸限制,NoV引起的爆發疫情可能會回升至新冠肺炎疫情前的水平甚至有可能超過原先水平[18]。海南省將通過對NoV爆發持續監測以不斷完善相關的研究數據,及時了解本省NoV暴發的分子流行病學特征及流行株基因組變異規律,對今后海南省NoV疫情防控策略的加強與調整提供科學依據。