農(nóng)田土壤好氧氨氧化和甲烷氧化交互作用機制的研究進展

潘紅 李江葉 馮浩杰 婁燕宏 楊全剛 王會 諸葛玉平

摘 要 從農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中硝化和甲烷氧化的研究意義、氨氧化和甲烷氧化的功能微生物演替規(guī)律，以及二者交互作用機制三個方面綜述了現(xiàn)階段取得的主要研究成果，并進一步闡述了土壤碳氮元素生物地球化學(xué)循環(huán)機制研究的科學(xué)問題和面臨的挑戰(zhàn)。未來研究應(yīng)充分利用學(xué)科交叉，結(jié)合宏觀結(jié)果和土壤微觀動態(tài)過程，揭示土壤中不可培養(yǎng)微生物代謝能力及其在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用，逐步實現(xiàn)對土壤生態(tài)過程的預(yù)測和調(diào)控。

關(guān)鍵詞 氨氧化；甲烷氧化；交互作用；氨氧化細菌（AOB）；氨氧化古菌（AOA）；甲烷氧化菌（MOB）

氧化亞氮（N2O）和甲烷（CH4）是含量僅次于二氧化碳（CO2）的溫室氣體，其溫室效應(yīng)潛能分別是CO2的298和25倍。有氧土壤中N2O的主要產(chǎn)生路徑是硝化作用，而氨氧化過程是硝化作用的關(guān)鍵限制反應(yīng)。氨氧化過程是由具有氨單加氧酶基因的氨氧化微生物驅(qū)動，包括氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）以及完全氨氧化微生物（Comammox）。好氧甲烷氧化是由具有甲烷單加氧酶的甲烷氧化微生物完成。研究發(fā)現(xiàn)，甲烷氧化和氨氧化之間具有復(fù)雜的交互作用關(guān)系，甲烷氧化和氨氧化微生物都是既可以氧化甲烷又可以氧化氨?；诜€(wěn)定同位素核酸探針（DNA-SIP）技術(shù)，有研究發(fā)現(xiàn)甲烷氧化能力對外源氮添加表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象[1]，但也有研究發(fā)現(xiàn)外源氮添加可同時刺激甲烷氧化和氨氧化活性[2]；洛桑試驗站的大田研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)銨態(tài)氮肥顯著抑制甲烷氧化[3]。隨著環(huán)境基因組學(xué)與土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)等學(xué)科交叉融合的迅速發(fā)展，氨氧化和甲烷氧化交互作用機制的相關(guān)研究越來越深入，逐漸成為微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。本文就農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氨氧化和甲烷氧化交互作用機制的研究作一綜述。

1 農(nóng)田土壤硝化和甲烷氧化的研究意義

當(dāng)前全球最大的挑戰(zhàn)之一是保證糧食安全與生態(tài)環(huán)境安全的同時，解決日益增長的人口和日益縮減的耕地面積之間的矛盾。在中國，這一挑戰(zhàn)顯得尤為艱巨，因為中國要用世界7%的耕地面積養(yǎng)育世界21%的人口，這一“中國奇跡”的背后有化學(xué)氮肥大規(guī)模施用的重要貢獻[4]。據(jù)統(tǒng)計，中國是世界上最大的化學(xué)氮肥消耗國，總用量達到了全球總量的33%[5]。大量的氨態(tài)氮肥進入土壤后迅速進行硝化作用。硝化作用是連接固氮作用與反硝化作用的中間環(huán)節(jié)， 不僅決定著植物對氮素的有效利用程度， 同時與過量氮肥投入導(dǎo)致的土壤酸化、硝酸鹽淋失及其引起的水體污染和溫室氣體N2O釋放等一系列生態(tài)環(huán)境問題直接相關(guān)， 構(gòu)成氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)[6]。

硝化作用的終產(chǎn)物硝態(tài)氮（NO-3-N）極易淋失，據(jù)估計，到2050年，世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的NO-3-N淋失預(yù)計達61.5 Tg N[7]。硝化作用的副產(chǎn)物N2O因其在大氣中的超長壽命（約121年）及其298倍于CO2的全球增溫潛勢廣受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，升溫2? ℃將導(dǎo)致全球土壤中釋放約2 300億噸碳[8]，溫室氣體減排刻不容緩。全球農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，大約4%的人為氮源施入會以N2O的形式進入大氣[9]，陸地生態(tài)系統(tǒng)90%的N2O源自硝化過程[10-11]。因此，明確硝化作用的過程機制，量化農(nóng)田土壤中硝化作用對N2O微生物釋放的相對貢獻，對有的放矢的減少硝態(tài)氮淋失，實現(xiàn)溫室氣體減排，提高肥料利用率具有重要意義。

甲烷（CH4）是僅次于CO2的第二大溫室氣體，全球輻射效應(yīng)的20%～30%源自CH4[12]。大氣中CH4濃度已由工業(yè)化前的700 ppb增長到現(xiàn)在的1? 850.5 ppb[13]。大氣CH4濃度的增加體現(xiàn)出CH4產(chǎn)生與消耗的不平衡。大氣中的甲烷80%以上是在對流層發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)被氧化，其余的甲烷主要由土壤中的甲烷氧化菌消耗[14]。森林土、草原土和旱作農(nóng)田土壤是CH4的有效“匯”，中國旱地土壤每年大氣甲烷氧化量高達 ?4 700萬t[4]。相比對流層CH4氧化，土壤甲烷氧化菌對大氣甲烷的氧化僅占全球甲烷匯的5%～15%，但該過程是目前已知的消耗大氣甲烷的唯一生物匯，對保持大氣甲烷濃度平衡具有重要意義[15]。如果沒有土壤作為CH4匯，大氣中CH4濃度會以目前增長速率的1.5倍急速增加[16]。因此，系統(tǒng)研究土壤甲烷氧化，提高土壤甲烷“匯”的能力，對增加土壤有機碳儲存，減少CH4排放，實現(xiàn)碳中和碳達峰的雙碳目標(biāo)具有重要的科學(xué)意義。

2 氨氧化和甲烷氧化過程及其功能微生物的群落演替規(guī)律

.1 氨氧化過程及其功能微生物的群落演替 ?規(guī)律

硝化作用是氨氣（NH3）氧化成亞硝態(tài)氮（NO-2-N），再氧化成硝態(tài)氮（NO-3-N）的兩步過程。其中，氨氧化過程是由編碼氨單加氧酶基因（amoA）的氨氧化微生物（氨氧化古菌AOA和氨氧化細菌AOB）主導(dǎo)完成，該過程是硝化作用的第一步也是限速步驟，是全球土壤氮素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。AOA和AOB在不同的土壤環(huán)境中對硝化作用的相對貢獻不同，二者存在一定的生態(tài)位分異。相比AOB，AOA更傾向于比如低氮、強酸性和高溫等比較“苛刻”的環(huán)境發(fā)揮功能活性，這可能與AOA對底物NH3極強的親和力有關(guān)，也可能與AOA生長易受有機氮而非無機氮的刺激有關(guān)[17]。不過，近來也有研究發(fā)現(xiàn)一些隸屬于Nitrosocosmicus 屬的AOA對氨的親和力與AOB相近[18]。這一結(jié)果對于廣泛認知的高氮土壤AOB主導(dǎo)硝化，低氮土壤AOA主導(dǎo)硝化這一結(jié)論提出挑戰(zhàn)。

2015年，Daims等[19]和van Kessel等[20]發(fā)現(xiàn)了獨立完成氨氧化和亞硝酸鹽氧化的全程氨氧化微生物，并將其命名為comammox（complete ammonia oxidizing bacteria）。類似AOA和AOB，comammox同樣編碼amoA基因，且其amoA基因具有獨特的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征，因而可作為理想的生物標(biāo)志物被識別和定量[21]。但是在土壤硝化過程中，基于DNA-SIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)，低氮處理的水稻土和森林土comammox clade B表現(xiàn)出硝化活性[22]；而在草原土中，氮肥施用顯著增加comammox clade A豐度，clade A表現(xiàn)出硝化活性[23]。

盡管AOA，AOB和comammox廣泛存在于土壤系統(tǒng)中，但它們之間并非相互排斥的存在，這可能源于他們本身的生理學(xué)特征，比如對NH3完全不同的半飽和常數(shù)等，使其具有不同的生態(tài)位[24]。研究發(fā)現(xiàn)comammox對底物NH3的親和力遠高于AOA和AOB，據(jù)此推測在寡營養(yǎng)環(huán)境中，相比AOA和AOB，comammox可能更具有競爭力[25]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，尿素添加顯著增加comammox功能基因豐度[26]。因此，重新評估農(nóng)田土壤中AOA，AOB和comammox的生態(tài)位分異及AOA/AOB對N2O釋放的相對貢獻對深入揭示土壤氮素轉(zhuǎn)化過程具有重要意義。

2.2 甲烷氧化過程及相關(guān)功能微生物的群落演替規(guī)律

CH4在甲烷氧化菌（MOB）的作用下被氧化為甲醇是甲烷氧化的關(guān)鍵步驟，該過程是由甲烷單加氧酶（MMO）催化完成。MMO可分為可溶MMO（sMMO）和顆粒MMO（pMMO），編碼sMMO的mmoX基因僅存在于少數(shù)種類的甲烷氧化菌中，而編碼pMMO大亞基的pmoA基因存在于除Methylocella，Methyloferula 和Methyloceanibacter之外所有的甲烷氧化菌中[27]。sMMO的合成對環(huán)境的要求不高，而且具有廣泛的底物范圍，可氧化烷烴、烯烴和芳香族化合物[28]；而pMMO只能氧化甲烷和5個碳以內(nèi)的短鏈化合物，具有對底物專一性和親和力強的特點[29]。研究表明，基于pmoA基因和基于16S rRNA基因的甲烷氧化菌的系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系基本一致[30]。因此，pmoA和甲烷氧化菌的特異16S rRNA 基因常被作為分子標(biāo)靶開展甲烷氧化菌多樣性的分子生態(tài)學(xué)研究[31]。

基于種系發(fā)生，目前的研究發(fā)現(xiàn)好氧甲烷氧化菌主要隸屬于γ-變形菌門（Ⅰ型和Ⅹ型），α-變形菌門（Ⅱ型），疣微菌門（Ⅲ型）和NC10菌門。Ⅰ型甲烷氧化菌具有r-生長策略，Ⅱ型甲烷氧化菌具有k-選擇的生存策略[32]。相比Ⅱ型甲烷氧化菌，原生動物更傾向于以Ⅰ型為食，這可能是原位大田條件下Ⅱ型為主導(dǎo)甲烷氧化菌群的原因之一[33]。此外，Ⅱ型甲烷氧化菌自身具有固氮能力，較Ⅰ型更適合在貧營養(yǎng)條件下生存，而且Ⅱ型甲烷氧化菌在不利的環(huán)境條件下會形成休眠狀態(tài)以避免死亡[34-39]。因此，Ⅰ型甲烷氧化菌生存能力相對較弱，而Ⅱ型甲烷氧化菌生存能力較強，能在營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中生存[40]。

土壤中還存在一些不同于以上傳統(tǒng)甲烷氧化菌的微生物，具備極高的底物親和力，可以氧化大氣中濃度僅為1.85 ppm左右的甲烷。這種大氣甲烷氧化菌（atmMOB）被命名為USCα （upland soil cluster α）和 USCγ（upland soil cluster γ）。前者主要活躍在中性和酸性土壤[41-45]，后者更適應(yīng)中性和堿性土壤[46-47]。atmMOB對人為擾動響應(yīng)非常靈敏，研究發(fā)現(xiàn)，在自然狀態(tài)下的旱地土壤中，atmMOB是主要的甲烷氧化菌，而在人為擾動（比如耕種，施肥）的旱地土壤中，傳統(tǒng)的甲烷氧化菌占據(jù)主導(dǎo)地位[48]。比如，Cai等[49]發(fā)現(xiàn)稻田土壤中同時發(fā)生的高親和力和低親和力甲烷氧化是由傳統(tǒng)甲烷氧化菌催化的，而不是由新型大氣甲烷氧化菌催化的。

甲烷氧化菌不僅消耗溫室氣體甲烷，而且是維持土壤肥力的重要生物因子[50]，系統(tǒng)掌握農(nóng)田土壤中甲烷氧化菌的生物學(xué)特征對有效管理甲烷的生物匯，實現(xiàn)溫室氣體減排，提高土壤有機碳儲量具有重要意義。

3 氨氧化和甲烷氧化的交互作用研究

甲烷氧化菌的pMMO和氨氧化菌的AMO是同系物，結(jié)構(gòu)極為相似，均屬于含銅膜單加氧酶（CuMMO）家族[51]。甲烷氧化菌和氨氧化菌對同樣的抑制劑反應(yīng)靈敏，都具有羥胺氧化還原酶系統(tǒng)，依賴好氧環(huán)境，其進化上的相似性，加之它們底物分子結(jié)構(gòu)的相似性（NH3和CH4），導(dǎo)致其具備功能上的相似性[52]。而且，MMO是一種對底物選擇性很低的酶，容易與很多化合物發(fā)生偶然的代謝作用[53]，高濃度的NH3可以將CH4從結(jié)合位點上驅(qū)趕下來，所以通常CH4的代謝是在氨氧化作用完成之后才開始進行。不過，氨氧化菌氧化CH4的最大氧化速率上限只有甲烷氧化菌氧化CH4的最大氧化速率下限的20%，對NH3的親和力也遠高于甲烷。同時，甲烷氧化菌對NH+4-N的利用效率遠遠高于氨氧化菌對CH4的利用率，因為礦氮對MOB合成自身生物量至關(guān)重要，尤其是對自身沒有固氮能力的甲基營養(yǎng)微生物，所以NH+4-N會和CH4發(fā)生競爭，因而抑制甲烷氧化菌對CH4的利用，導(dǎo)致CH4排放量的增加。同時，甲烷氧化過程中的中間產(chǎn)物甲醇可能對硝化微生物具有抑制效應(yīng)，而硝化過程的中間產(chǎn)物羥胺對甲烷氧化微生物同樣具有毒性。因此，以甲烷氧化和氨氧化為代表的這種碳氮轉(zhuǎn)化過程相互影響，錯綜復(fù)雜（圖1）。

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，化肥施用可能因為提供了微生物必須的氮/碳源而增加甲烷氧化能力，也可能因為增加了微生物競爭位點而抑制甲烷氧化能力?；诼迳Ｔ囼炚镜难芯堪l(fā)現(xiàn)，在旱地土壤中（麥田和草地），外加氮源對甲烷氧化的影響取決于氮肥的形態(tài)（NH+4-N或者NO-3-N），NH+4抑制甲烷氧化，NO-3對土壤甲烷的氧化不僅沒有影響，可能還有刺激作用[3]。而在中國內(nèi)蒙古草原土壤中通過13C-DNA-SIP分析發(fā)現(xiàn)，尿素態(tài)氮的添加對甲烷氧化的影響符合“低促高抑”，即低濃度尿素（20 μg·g-1 ）添加顯著刺激甲烷氧化活性和甲基營養(yǎng)微生物生長繁殖；而高濃度尿素（100 μg·g-1）添加顯著抑制甲烷氧化能力[1， 54]。同樣基于13C-DNA-SIP的稻田土壤和草原土壤的研究則發(fā)現(xiàn)，高濃度尿素（100? ?μg·g-1）或者（NH4）2SO4施入顯著刺激硝化和甲烷氧化活性[2，55]。洛桑試驗站大田結(jié)果與DNA-SIP室內(nèi)試驗結(jié)果不一致的原因一方面在于田間條件下，土壤暴露在大氣甲烷濃度下，而室內(nèi)培養(yǎng)試驗以高濃度甲烷處理土壤，可能人為選擇了甲烷氧化微生物種群，也會改變微生物區(qū)系，引起甲烷氧化能力的差異；另一方面在于土壤原有氮素水平的高低，氮是甲烷氧化菌的必需養(yǎng)分，其繁殖必須有適量氮素的供應(yīng)。事實上，土壤中以氨氧化和甲烷氧化為代表的碳氮代謝之間的交互作用，很大原因在于土壤碳氮代謝相關(guān)功能微生物之間的競爭性交互作用關(guān)系。研究表明，AOA與MOB[55]，AOB與MOB以及NOB與MOB[1]之間都存在競爭性交互作用關(guān)系。雖然功能微生物之間可能存在的競爭關(guān)系能比較好的解釋氨氧化和甲烷氧化之間的交互作用，但尚需通過大量田間試驗和室內(nèi)模擬試驗揭示或者探索土壤碳氮代謝過程中的新機制。此外，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)歷了以高水肥投入為主要特征的集約化進程，土壤肥力變化受人類活動和自然環(huán)境的綜合影響，長期外源肥力投入有可能對土壤甲烷“匯”功能產(chǎn)生抑制作用，如何采取有效措施恢復(fù)或者提升土壤氧化甲烷的能力將是一個有待研究者深入思考和解決的科學(xué)問題。

4 研究展望

宏基因組學(xué)、單細胞測序和光譜成像技術(shù)等新型技術(shù)的發(fā)展極大地推動了土壤學(xué)研究的突破，為揭開土壤中不可培養(yǎng)微生物代謝能力及其在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用提供了可能。盡管研究發(fā)現(xiàn)，土壤中大多數(shù)元素的生物地球化學(xué)循環(huán)是微生物介導(dǎo)的，但具體哪些微生物參與以及功能性如何尚不清楚。土壤中的不同元素轉(zhuǎn)化通常是緊密耦合，相互交聯(lián)，因此，在復(fù)雜土壤環(huán)境中，關(guān)注宏觀結(jié)果和微觀動態(tài)過程，解析土壤不同元素的轉(zhuǎn)化循環(huán)過程機制，有助于從簡單到復(fù)雜，逐步實現(xiàn)對土壤生態(tài)過程的預(yù)測和調(diào)控。以氨氧化和甲烷氧化為模式耦合生態(tài)過程，深入研究土壤碳、氮循環(huán)的耦合微生物機理，指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)碳氮調(diào)控，可以提升土壤甲烷“匯”的能力，提高土壤碳儲存，這對環(huán)境持續(xù)發(fā)展和農(nóng)業(yè)相關(guān)政策的制定巨有重要的參考和指導(dǎo)意義。此外，甲烷氧化和氮素轉(zhuǎn)化的偶聯(lián)不僅包括氨氧化過程，還包括固氮過程和反硝化過程等，因此， 無論從微生物學(xué)研究的微觀角度還是從農(nóng)田CH4/N2O排放的宏觀角度， 明確土壤碳氮轉(zhuǎn)化的耦合機制都具有重要意義。

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Advances of Research in Interactions between Ammonia?and Methane Oxidation in Agricultural Soils

Abstract This paper provides an overview of the research significance of nitrification and methane oxidation，the dynamic shifts in functional microbial communities associated with ammonia and methane oxidation， and the intricate interactions between these two processes.Furthermore，this review also highlights scientific challenges in soil carbon and nitrogen biogeochemical cycle. To address these challenges，further studies should adopt an interdisciplinary approach， combining macroscopic findings with microscopic dynamics to elucidate the metabolic capability of unculturable microbes and their important roles in soil biogeochemical cycles.This will help predict and regulate soil ecological processes.

Key words Ammonia oxidation; Methane oxidation; Interaction; Ammonia oxidizing bacteria （AOB）; Ammonia oxidizing archaea （AOA）; Methane oxidizing bacteria （MOB）