腦心肌炎增強型綠色熒光蛋白嵌合病毒的構建

徐超 楊曉煉 朱書

摘 要 攜帶增強型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）的腦心肌炎（Encephalomyocarditis virus，EMCV）嵌合病毒是研究該病毒體內外生物學特性的有力工具。因此，本研究基于前期構建的巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染性克隆，在EMCV基因組2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段，并將重組質粒轉染BHK-21細胞，獲得攜帶EGFP的嵌合病毒。通過熒光定量PCR（real-time PCR）、間接免疫熒光（Indirect immunofluorescence assay，IFA）及半數組織細胞感染量測定（Median tissue culture infective dose，TCID50）等方法對拯救病毒的基因組復制、蛋白表達及病毒粒子的感染性進行測定，結果證實嵌合病毒能夠在BHK-21細胞上成功表達EGFP并產生完整的病毒粒子。然而，相較于野生型親本拯救病毒，嵌合病毒在BHK-21細胞上的復制能力降低，并且在連續傳代后逐漸失去綠色熒光信號，表明嵌合病毒中EGFP基因的插入對EMCV病毒粒子的組裝釋放具有不良影響，并在傳代過程中逐漸累積導致EGFP功能喪失的缺失和突變。

關鍵詞 腦心肌炎病毒； 增強綠色熒光蛋白； 嵌合病毒

腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）是一種人獸共患病毒，屬于微RNA病毒科心病毒屬，與同科的脊髓灰質炎病毒、腸道病毒71型以及柯薩奇病毒一樣，是通過糞口途徑傳播的病毒之一。EMCV具有廣泛的宿主嗜性，主要感染嚙齒類、豬及靈長類動物，并導致腦炎、心肌炎、生殖障礙和糖尿病等多系統疾病。

攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的嵌合病毒是研究病毒感染、復制以及致病性的有力工具，是插入病毒基因組的一種常用外源基因。Engel-herbert等[1]利用重組新城疫病毒中GFP的自發熒光，對器官外植體和原代氣管細胞中被病毒感染的細胞進行追蹤。GFP也為流式細胞術監測感染提供了一種簡便、直接、快速的方法。如Dominguez等[2]利用流式細胞術檢測重組痘苗病毒中的GFP標記，并將其與細胞類型特異性標記物結合使用，顯示了其在研究病毒趨化性中的實用性。此外，利用GFP能用來直接觀測病毒在細胞間的傳播，如Duprex等[3]拯救了一株表達增強型綠色熒光蛋白的重組麻疹病毒，借助共聚焦顯微鏡實時監測嵌合病毒感染人星形細胞瘤細胞后在細胞間的傳播。Plattet等[4]在犬瘟熱病毒中插入了一段EGFP序列，從而能夠敏感地追蹤活細胞中病毒的感染，繼而研究病毒在自然宿主中的持續感染和毒力。可見，插入了外源GFP片段的嵌合病毒，能夠為相關病毒的體內外研究提供巨大便利。

因此，本研究基于前期構建的CMV感染性克隆，在EMCV基因組2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段，并將重組質粒轉染BHK-21細胞，以期獲得攜帶EGFP的嵌合病毒，為開展EMCV的感染特性、致病機制和相關疾病模型構建等研究提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和試驗動物

BHK-21細胞購于中國科學院細胞庫（ATCC）編號為GNHa10；EMCV BJC3毒株由中國農業大學農業部動物流行病學重點實驗室分離和鑒定，浙江大學腸道微生物互作與動物健康實驗室保存（以下稱本實驗室）；實驗動物：無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級別的6～8周齡C57BL/6J小鼠購買于南京模式動物所，在獨立通風籠具（IVC）中飼養。

1.2 載體和菌株

pRK5-EGFP模板質粒：由本實驗室保存；平末端T載體pEASY-Blunt購自擎科生物技術有限公司；大腸桿菌DH5α購于全式金生物技術有限公司。

1.3 主要試劑

高保真PCR酶、無縫克隆試劑盒購自擎科公司；膠回收試劑盒購自美國OMEGA生物技術公司；去內毒素質粒大提試劑盒購自美國OMEGA生物技術公司；質粒大提試劑盒購自德國QIAGEN生物公司；THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit：購自日本TOYOBO公司；反轉錄試劑盒：購自InvitrogenTM公司；EMCV VP1、VP2蛋白的鼠源單克隆抗體（McAb）、EMCV陰性SPF鼠血清：由本實驗室制備保存；HRP標記的兔抗鼠IgG、IgA、IgM二抗：購自Abcam公司。

1.4 引物設計

在EMCV的2A序列后插入EGFP基因（將EGFP的終止密碼子突變成了GAA）和 ?T2A基因，設計引物見表1。

1.5 擴增模板質粒pRK5-EMCV的引物

根據EMCV-BJC3株基因組序列，將2A序列之前的片段分成兩段進行擴增。首先，在模板質粒pRK5-EMCV的3′端序列和第1～29位堿基處設計引物F（1～29），在模板質粒的第3 955～ ?4 005位堿基設計引物R1（3 955～4 055），利用引物F/R1擴增EMCV基因組中約4 000 bp大小的片段。其次，在3 955～4 005處設計引物F1（3 955～4 005），與引物R1互補，并在模板質粒第4 764～4 787位堿基處和EGFP的第1～21位設計引物R2（4 764～4 787+EGFP），利用F1和R2可得到約850 bp大小的片段。利用F/R1和F1/R2這兩對引物便可將EMCV的2A序列之前的片段擴增下來，引物序列見表1，均由杭州有康公司合成。[FL）]

1.6 擴增外源片段EGFP和T2A的引物

在模板質粒4 764～4 787和EGFP的第1～21位堿基處，設計與R2互補的引物F2（4 764～ ?4 787+EGFP），在EGFP序列的第697～717位和T2A（共51個核苷酸）的第1～42位堿基處設計引物R0，并將EGFP末端的終止密碼子突變為GAA，同時，在T2A的第20～51位堿基和模板質粒第4 788～4 812位處設計引物R。

首先利用引物F2/R0擴增EGFP片段，然后利用引物F2/R在EGFP片段末端連接T2A片段，經過兩次擴增，可得到含有 ?EGFP+T2A的基因片段。引物序列見表1，均由杭州有康公司合成。

1.7 外源片段的擴增

利用引物F/R1，擴增模板質粒，獲得大小為4 kb的片段EMCV-4000；利用引物F1/R2擴增模板質粒，獲得大小為850 bp 的片段EMCV-850；利用引物F2/R0和F2/R擴增獲得含有EGFP和 ?T2A基因的片段EGFP-T2A-820。使用I-5TM 2×High-Fidelity Master Mix（擎科公司）進行擴增，將PCR產物用于瓊脂糖凝膠電泳和片段回收，獲得上述3個片段。由于獲得的3個片段之間含有互補的序列，利用融合PCR進行連接。利用瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定融合PCR產物，切取目的片段回收并測定濃度，獲得連接后的全長大小約為5 kb。最后將插入片段和線性化的模板質粒進行同源重組，將重組質粒轉染感受態細胞，凍存保存。

1.8 重組質粒的鑒定

首先設計鑒定引物F和R，采用PCR凝膠電泳對電泳結果進行鑒定分析，其次將PCR產物克隆培養，送公司測序，最后對比酶切圖譜進行 ?分析。

1.9 嵌合病毒拯救及毒力檢測

采用去內毒素的質粒大提試劑盒（QIAGEN Plasmid Maxi Kit）提取含有重組嵌合病毒基因全長的EMCV-EGFP質粒，并利用分光光度計測定獲得的質粒濃度。利用脂質體2000（Lipofectamine 2000，LIP 2000）轉染試劑進行轉染，每隔一段時間觀察細胞病變（cytopathic effect，CPE）、增強綠色熒光蛋白表達和轉染效率，以確定病毒拯救成功與否。

1.10 重組質粒轉染BHK-21細胞后的RNA拷貝數檢測

F0代將“1.9”的細胞轉染36 h后，用TRIzol法提取RNA，并使用DNaseⅠ（RNase-free）對RNA進行純化，取適量處理后的RNA，利用real-time PCR檢測嵌合病毒EMCV-EGFP的RNA拷貝數。 F1代將重組質粒EMCV-EGFP轉染BHK-21細胞36 h后，收取轉染后細胞樣品，反復凍融3次，離心去除細胞碎片后，取上清接種于BHK-21細胞。于接種36 h后取細胞上清，利用TRIzol法提取RNA，利用real-time PCR檢測嵌合病毒EMCV-EGFP的RNA拷 ?貝數。

1.11 嵌合病毒感染BHK-21細胞后的病毒滴度測定

F0代將BHK-21細胞按照適當密度接種于96孔細胞培養板，取“1.9”中轉染后36 h細胞上清樣，用2%DMEM按照10-2到10-10進行10倍梯度稀釋，100 μL/孔接種于96孔板的細胞上，最后一列加2%DMEM作為陰性對照。于48 h后觀察細胞病變并統計，計算TCID50。F1代將重組質粒EMCV-EGFP轉染BHK-21細胞36 h后，收取轉染后細胞樣品，反復凍融3次，離心去除細胞碎片后，取上清接種于BHK-21細胞。于接種36 h后取細胞上清，用2%DMEM按照10-2到10-10進行10倍梯度稀釋，100 μL/孔接種于96孔板的細胞上，最后一列加2%DMEM作為陰性對照。于48 h后觀察細胞病變并統計，并計算TCID50。

2 結果與分析

2.1 重組質粒EMCV-EGFP的鑒定和測序分析

以重組質粒EMCV-EGFP為模板，利用引物F/R（序列見表1）對插入片段進行PCR擴增，PCR產物使用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定大小，結果獲得5 kb大小的目的條帶，初步證明外源片段與模板質粒重組成功。

同時，將獲得的重組質粒送測序驗證（杭州有康公司），將測序結果與模板質粒pRK5-EMCV及EGFP、 ?T2A的基因序列進行比對，結果完全一致，表明外源片段EGFP和 T2A成功插入模板質粒，且沒有發生突變。

2.2 嵌合病毒的拯救

將重組質粒EMCV-EGFP轉染BHK-21細胞后，觀察是否導致細胞病變，并在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況（圖1）。

結果顯示，陽性對照EMCV-RV感染的細胞在16 h開始出現病變，至24 h細胞完全病變，而EMCV-EGFP孔在24 h時幾乎沒有看到細胞病變，大約在36 h開始出現少量病變。

陽性對照pRK5-EGFP質粒在轉染16 h便出現熒光，在24 h左右達到最大值，EMCV-EGFP在24 h時開始有綠色熒光蛋白表達， 在36 h左右達到最大值，但熒光數量和強度要低于pRK5-EGFP孔。

以上結果說明，相對于拯救病毒EMCV-RV，嵌合病毒在BHK-21細胞上的感染增殖能力下降，對BHK-21細胞的毒力減弱。

2.3 免疫熒光（IFA）檢測嵌合病毒蛋白的表達

將EMCV-EGFP質粒轉染BHK-21細胞后24 h的樣品做IFA，結果如圖2所示。可見，EMCV的衣殼蛋白VP2（紅色熒光標記）在細胞內表達，而插入的EGFP在同一細胞內發出綠色熒光，說明插入片段能夠伴隨著病毒的復制而表達。[FL）]

2.4 嵌合病毒的基因組RNA拷貝數檢測

將重組質粒EMCV-EGFP和野生型感染性克隆質粒pRK5-EMCV轉染BHK-21細胞后，在36 h收樣，并取凍融液提取RNA并用DNsae純化，以去除質粒對病毒RNA檢測的干擾，然后利用real-time PCR檢測嵌合病毒EMCV-EGFP的RNA拷貝數，3次重復試驗的檢測結果見表2。

結果表明，EMCV-EGFP轉染BHK-21細胞后仍然能夠產生子代病毒RNA，但是相對于野生感染性克隆質粒pRK5-EMCV來說，RNA拷貝數有所下降。

2.5 嵌合病毒感染BHK-21細胞后的病毒滴度測定

將重組質粒EMCV-EGFP和野生型感染性克隆質粒pRK5-EMCV、突變感染性克隆質粒EMCV-T776A轉染BHK-21細胞后，36 h取樣，檢測F0代病毒滴度；同時繼續接種細胞，檢測F1代病毒滴度，統計結果如表3所示。

拯救病毒和突變病毒在轉染F0代均能檢測到病毒粒子，且在F1代時病毒滴度增加了約100倍，但是嵌合病毒EMCV-EGFP在F0代和F1代均只能檢測到低水平的病毒滴度，說明嵌合病毒感染BHK-21細胞并產生完整病毒粒子的能力下降。

3 討? 論

一般來說，要檢測細胞或者組織內的病毒粒子，主要通過檢測病毒蛋白或者核酸的水平來確定。而另一種方法則是在病毒基因組內插入外源基因標記，從而間接檢測病毒感染情況。增強型綠色熒光蛋白（EGFP）已經被廣泛應用于多種病毒的標記，對于體外或者體內感染細胞的鑒定十分方便直觀。

本研究構建了帶有EGFP標記的EMCV嵌合病毒，能夠產生病毒基因組RNA拷貝且能產生完整病毒粒子，借助熒光顯微鏡可以在被感染的細胞內觀測到EGFP的表達。然而，相較于野生型親本拯救病毒，嵌合病毒在BHK-21細胞上的復制能力降低，并且在連續傳代后逐漸失去綠色熒光信號，表明嵌合病毒中EGFP基因的插入對EMCV病毒粒子的組裝釋放具有不良影響，并在傳代過程中逐漸累積了導致EGFP功能喪失的缺失和突變。

一方面，對于微RNA病毒科的病毒來說，基因大小的增加，會對完整病毒粒子的包裝產生影響。有研究表明，比脊髓灰質炎病毒（Polioviruses）基因長度多17%的重組病毒可以正常復制和包埋，但是插入的基因片段對病毒復制會產生不利影響。然而，如果將脊髓灰質炎病毒或者門戈病毒（Mengovirus）的基因延長20%以上，會妨礙病毒粒子的包裝，從而影響完整病毒粒子的產生[5-6]。與脊髓灰質炎重組病毒有關的研究表明，外源性病毒結構可能會對病毒的復制周期產生干擾[7-8]。比如當泰勒病毒（Theilers virus）的基因組增加了724個堿基（nt）時，病毒的復制會受到一定的抑制[9]；當門戈病毒的基因組增加459 nt時，與親本病毒相比，重組病毒的復制推遲且產量有所下降[10]。同樣可以推測，在EMCV中插入長度約為700 bp的外源EGFP片段，對EMCV的病毒復制周期產生了影響，并且抑制了完整病毒粒子的包裝和釋放。

另一方面，嵌合病毒EMCV-EGFP在BHK-21細胞上生長緩慢且難以產生完整病毒粒子的原因可能是插入的EGFP片段對2A蛋白的功能產生了影響。EMCV的2A蛋白基因位于病毒衣殼蛋白基因VP1之后，它是一種17 ku的小蛋白（圖3），由143個氨基酸組成，具有高度堿性，被認為是EMCV除了L蛋白外的第二個病毒安全蛋白[11]。有研究證實，2A是影響EMCV致病性的關鍵蛋白，野生型EMCV能導致小鼠急性死亡，但是2A蛋白缺失的毒株卻對小鼠無明顯毒性作用，不導致其死亡[12]。在體外，2A蛋白缺失的病毒會影響病毒粒子的釋放，并且細胞出現病變的時間延后，細胞存活率增加，這與前述研究結果相吻合，在2A蛋白后插入了外源片段的嵌合病毒在BHK-21細胞上也表現出與之相似的特性。此外，2A蛋白還能抑制細胞凋亡（圖4）。當2A蛋白的功能受到影響時，病毒在細胞內的復制引起宿主細胞啟動凋亡程序，從而抑制了病毒的進一步增殖[13]。

總之，本研究在基于CMV啟動子構建的EMCV感染性克隆基礎上，使用了融合PCR的方法插入外源EGFP片段，此構建策略使得插入的外源基因不會引入任何冗余片段，減少了對病毒基因組的影響，且試驗操作相對簡單易行。本研究已證實嵌合病毒能夠在BHK-21細胞上增殖，且能夠在熒光顯微鏡下觀測到EGFP的表達，接下來將進一步優化嵌合病毒的構建方法，并研究低代病毒對動物靶器官的感染能力，實現對體內病毒感染的追蹤，研究病毒的發病和傳播機制，為相關疾病模型的深入研究提供有力工具。

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Construction of Encephalomyocarditis Virus for Enhancement of Green Fluorescent Protein Chimeric Virus

Abstract Chimeric? Encephalomyocarditis Virus （EMCV） with an enhanced green fluorescent protein （EGFP） insertion is a powerful tool for investigating biological characteristics both in vitro and in vivo. In this study，we introduced the EGFP coding gene at the downstream flank of the genome sequence that encodes EMCV 2A protein on the basis of previously constructed cytomegalo? virus（CMV）-driven infectious clone. The EGFP chimeric virus was obtained by transfecting BHK-21 cells with the recombinant plasmid.We evaluated genomic replication，protein synthesis，and the infectivity of chimeric viral particles through real-time PCR，immunofluorescence assay （IFA），and TCID50 assay. The collective data demonstrated that recombinant plasmid transfection resulted in viable chimeric virus progenies expressing EGFP in BHK-21 cells. However，the chimeric virus exhibited hampered replication capacity and gradually diminished green fluorescence signals through passages. This suggests that EGFP genetic insertion impaired the assembly and release of chimeric virus particles，and the accumulated depletion and mutation during continuous passaging gradually led to the malfunction of EGFP.

Key words Encephalomyocarditis virus; Green fluorescent protein enhancement; Chimeric virus