采后黃瓜在冷馴化處理過程中的轉錄組變化

王斌 楊盼迪 王玉昆 蔣園園

摘 要 采后黃瓜是冷敏性果菜類蔬菜，在低溫貯藏時易發(fā)生冷害。前期研究結果表明，冷馴化處理通過誘導采后黃瓜耐冷性，減少冷害發(fā)生。為探究冷馴化處理誘導的轉錄組學變化，以采后黃瓜為試材，分析冷馴化處理期間的轉錄組變化。與貯藏前（0 h）相比，在冷馴化處理12 h和72 h時，分別鑒定到1 870和3 550個差異表達基因。基因表達驗證結果表明，RT-qPCR和轉錄組結果高度一致，證明轉錄組測序數據的準確性和可靠性。GO富集分析結果顯示，冷馴化處理誘導的差異表達基因主要富集在氧化還原過程、細胞膜組分和轉錄因子活性3個GO途徑中，表明冷馴化處理通過調節(jié)細胞膜組分、細胞內氧化還原狀態(tài)，增強冷藏黃瓜耐冷性。進一步分析發(fā)現，104個轉錄因子基因響應冷馴化低溫，差異表達的轉錄因子主要是ERF、bZIP、WRKY和HSF家族，表明轉錄因子介導的轉錄調控在冷馴化誘導的耐冷性中發(fā)揮重要作用。研究結果為采后黃瓜誘導耐冷性提供了新見解，有助于加深對冷馴化誘導耐冷性分子機理的認識，為耐冷黃瓜培育提供了重要基因資源。

關鍵詞 采后黃瓜；耐冷性；冷馴化；轉錄組學分析；轉錄因子

黃瓜（Cucumis sativus L.）又名青瓜、刺瓜、胡瓜等，是葫蘆科黃瓜屬1 a生蔓生或攀援草本植物，最初起源于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū)，現在世界各地均有廣泛栽種，對低溫的耐受性較差［1］。黃瓜是重要的果菜類蔬菜，因營養(yǎng)豐富、口感清脆，深受消費者喜愛［2］。但采后黃瓜含水量很高，組織鮮嫩，采后呼吸作用仍比較旺盛，常溫條件下易失水萎蔫而腐爛變質，貯藏期很短［3］。低溫貯藏可有效抑制病原微生物的生長繁殖，降低采后果蔬的呼吸作用和乙烯釋放速率［4-5］。因此，在生產上，通常采用低溫貯運的方式，延長采后黃瓜的貯藏期［6］。但采后黃瓜對低溫特別敏感，低于10 ℃貯藏時就會發(fā)生冷害［7-8］。產生冷害的采后黃瓜在貨架期很快腐爛變質，導致商品性顯著降低，給果蔬經營者帶來很大的經濟損失［9］，嚴重制約采后黃瓜產業(yè)發(fā)展。

近年來，植物耐冷性研究已從生理生化轉向分子生物學研究，且對植物響應并耐受低溫脅迫的分子機制研究取得了很大進步［10-12］。關于植物耐受低溫脅迫的分子機制，在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中研究的比較多，分子調控機制研究的也相對清楚［13-14］。在擬南芥中的研究證實，CBF（C-repeat binding transcription factor/dehydrate responsive element binding factor，CBF/DREB）轉錄因子是調控植物耐冷性的關鍵因子，低溫處理激活CBF轉錄活性，隨后識別并與冷響應相關基因（COR）啟動子中的 ?CRT/DRE（C-repeat /dehydration responsive element）元件相結合，直接調控靶基因的表達［15-16］。擬南芥基因組中含有4個CBF基因，低溫處理能迅速誘導4個CBF基因的表達，過表達CBF基因能顯著增強轉基因擬南芥的耐冷性［17-18］。由于物種特異的原因，不同植物耐受低溫脅迫的分子機制可能存在明顯差異。此外，擬南芥等模式植物沒有嚴格意義上的肉質果實，與具有果實器官的園藝作物差異很大，離體的采后果實耐冷機制是否與仍處于生長狀態(tài)的植物相似，仍值得研究。

隨著第二代測序技術和生物信息學的聯合應用，轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）已成為研究植物耐冷分子機理的重要方法［19-20］。Xie等［21］利用Illumina nextseq 2 500 測序平臺，對低溫處理的地瓜果實進行轉錄組測序，發(fā)現低溫處理顯著誘導18 681個基因的表達，下調 ?21 983個基因的表達。低溫處理誘導的差異表達基因功能主要與細胞膜系統(tǒng)、抗氧化酶、碳水化合物代謝和激素代謝有關，推測地瓜可能通過調節(jié)激素平衡和提高抗氧化活性，以適應低溫脅迫［21］。通過分析苦瓜葉片在低溫處理后的轉錄組變化，發(fā)現了大量與低溫脅迫相關的代謝途徑，且鑒定出了10個潛在的具有低溫抗性的MYB、WRKY和NAC等轉錄因子基因［22］。采后果蔬病理與分子生物學課題組利用RNA-seq結合生物信息學分析的方法，鑒定了與黃瓜 ?GR-RBP3（Glycine-rich RNA-binding protein 3）表達趨勢一致的MYB轉錄因子基因，隨后證明MYB62直接調控 GR-RBP3表達［8］。這些研究表明，轉錄組測序是揭示采后黃瓜耐冷性分子機理的可靠技術手段。

采后果蔬病理與分子生物學課題組前期證實，適宜時長和溫度的冷馴化處理，能有效誘導采后黃瓜耐冷性，延緩冷害發(fā)生［9，23-27］，但冷馴化誘導采后黃瓜耐冷性的分子機理仍未探明。分析采后黃瓜響應冷馴化處理的轉錄組學變化，能為采后黃瓜誘導耐冷性分子機理提供新見解［23］。

本研究以采后黃瓜果實為試材，分析冷馴化處理過程中的轉錄組變化，并鑒定與采后黃瓜耐冷性密切相關的轉錄因子基因，以期加深人們對采后黃瓜誘導耐冷性的理解，為黃瓜分子育種提供重要基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試黃瓜品種為‘翠夏，父母本信息不詳，種子由廣東現代種業(yè)發(fā)展有限公司提供。黃瓜果實在適宜成熟度時采收，采收后立即運回實驗室。按照如下標準挑選采后黃瓜樣品：果實長度約為30 cm，縱切面直徑約3 cm，果皮表面無明顯蟲害和藥害癥狀，果皮表面的果刺沒有明顯脫落，果形筆直，兩端粗細均一。

將挑選好的黃瓜分成3組，代表3個生物學重復，每組30根。裝在塑料框中，用塑料薄膜保鮮袋密封包裝。先將采后黃瓜在10 ℃的低溫恒溫培養(yǎng)箱中貯藏72 h，之后再轉移至5 ℃貯藏，低溫培養(yǎng)箱的相對濕度為95%～98%。在10 ℃貯藏0 h、12 h和72 h時，取樣用于轉錄組測序分析。收集黃瓜果皮作為分析樣品，用市售普通去皮刀削下果皮，果皮厚度約1 mm。立即用液氮速凍處理，并凍存于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 冷藏黃瓜冷害評估指標 冷害指數（Chilling injury index，CII）、相對電導率（Relative electrical conductivity，REC）和PSⅡ原初光能轉化效率（Fv/Fm）3個指標反映采后黃瓜的冷害嚴重程度。CII、REC和Fv/Fm測定方法見文獻［23，26］。

1.2.2 總RNA提取、文庫構建和RNA-seq 將凍存樣品在液氮中研磨，使用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（產品編號：DP441）提取黃瓜果皮總RNA。分別使用Agilent Bioanalyzer 2 100和Nano DropTM儀器檢測RNA樣品的濃度和質量，運用Illumina TruSeqTM? RNA Sample Preparation Kit試劑盒構建cDNA文庫。ABI Step One Plus Real-Time PCR 系統(tǒng)定量cDNA文庫的有效濃度（＞2 nM），庫檢合格后，利用Illumina next seq 2 500 測序平臺測序［23］，測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學分析和差異表達基因篩選 轉錄組測序數據下機后，采用HISAT（Hierarchical indexing for spliced alignment of transcripts）方法［28］，以黃瓜基因組數據（http：//www.cucurbitgenomics.org/organism/20）作為參考基因組，進行序列比對及后續(xù)分析。采用DESeq2法比較樣品組間的基因表達差異［29］，獲得差異表達基因集。

利用NCBI 非冗余蛋白質數據庫（ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/）、GO （gene ontology）（http：//www.geneontology.org/）、大型蛋白質家族數據庫（http：//pfam.xfam.org/）、蛋白質直系同源數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）（http：//www.genome.jp/kegg）、蛋白質序列注釋數據庫Swiss-Prot（http：//www.uniprot.org/）等公共數據庫注釋基因［30］。利用 Blast2GO（https：//www. blast2go.org/） 進行差異表達基因的GO 注釋，通過P值（P< ?0.05） 的 Benjamini-Hochberg矯正方法確定差異表達基因中顯著富集的GO分類，使用Cytoscape （http：//www.cytoscape. org/）注釋通路。

采用FPKM（每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數）計算基因的表達量［22，31］。差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs）的篩選標準為：差異倍數（Fold change，FC）≥ ?2.5，且錯誤發(fā)現率（False discovery rate，FDR）＜0.01。

1.2.4 差異表達基因的表達驗證 采用熒光定量PCR（qRT-PCR）法驗證差異表達基因的表達水平。所用引物信息見表1，以黃瓜ACTIN作為內參基因。

1.3 數據整理與分析

使用Excel 2016軟件記錄和整理數據，通過Tbtools軟件繪制差異表達基因的表達熱圖［32］。

2 結果與分析

2.1 冷馴化處理對采后黃瓜冷害的影響

圖1顯示，采后黃瓜經10 ℃冷馴化處理72 h（3 d）后，冷害指數從0 d 時的0增加到12 d的 ?0.70，僅增加了0.70。相對電導率從0 d 時的 ?14.86%增加到12 d的27.38%，僅增加了 ?12.52%。Fv/Fm值在整個貯藏期間緩慢下降，從0 d 時的0.71下降到12 d的0.56，僅降低了0.15。

2.2 轉錄組測序數據質量評估

為分析采后黃瓜在冷馴化處理期間的轉錄組變化，選取0 h、12 h和72 h 3個時間點的黃瓜果皮樣品進行轉錄組測序。轉錄組測序共獲得 ?53.82 Gb的高質量數據（Clean data），基因組比對效率為89.43%～93.91%，總堿基對數平均值為7 111 873 467 bp，GC平均含量為 ?44.39%，Q20平均值為97.56%（表2）。這些結果表明，RNA seq數據質量很高，完全滿足生物信息學分析的要求。

將DEGs在NR、GO、KEGG等數據庫中比對，得到對應的注釋信息。0 h 與 12 h的比較組共注釋到1 870個差異表達基因，0 h 與 72 h的比較組共注釋到3 550個差異表達基因，12 h 與 72 h的比較組共注釋到1 818個差異表達基因（表3）。各數據庫的注釋結果如表3所示。

2.3 冷馴化處理12 h期間的轉錄組變化

與冷馴化處理前（0 h）相比，冷馴化處理12 h期間共鑒定到1 870個DEGs（圖2-A）。其中，906個DEGs表達上調，964個DEGs表達下調，下調表達的DEGs數量稍多于上調表達的DEGs數量（圖2-A）。說明在基因表達層面，冷馴化迅速誘導了采后黃瓜對低溫的適應反應。GO通路富集分析結果顯示，在生物過程類別中，氧化還原過程（oxidation-reduction process）、轉錄調控（regulation of transcription）和代謝過程（metabolic process）是3個富集DEGs數量最多的GO途徑，氧化還原過程富集度最高；在細胞組分類別中，DEGs主要富集在膜中間組分（integral component of membrane）亞類；在分子功能類別中，DEGs主要富集在轉錄因子活性（transcription factor activity）、血紅素結合（heme binding）和鐵離子結合（iron ion binding）亞類中（圖2-B），轉錄因子活性富集度最高。這些結果表明，氧化還原過程和轉錄調控可能在采后黃瓜適應低溫脅迫過程中至關重要。此外，冷馴化誘導細胞膜組分變化，可能是采后黃瓜響應低溫的重要方式。

2.4 冷馴化處理72 h期間的轉錄組變化

與冷馴化處理前（0 d）相比，冷馴化處理72 h期間共鑒定到3 550個DEGs，且DEGs的數量明顯多于12 h（圖3-A），表明冷馴化處理持續(xù)強化了采后黃瓜對低溫脅迫的適應能力。其中，冷馴化72 h處理誘導1 370個DEGs表達，抑制2 180個DEGs表達，下調表達的DEGs數量多于上調表達（圖3-A）。

GO富集結果顯示，在生物過程類別中，差異表達基因主要富集在氧化還原過程、轉錄調控和細胞氧化劑解毒（cellular oxidant detoxification）3個亞類中，氧化還原過程亞類中富集的DEGs最多；在細胞組分類別中，DEGs主要富集在膜中間組分、質膜（plasma membrane）和胞外區(qū)域（extracellular region）3個亞類，膜中間組分亞類的富集度最高；在分子功能類別中，DEGs主要富集在金屬離子結合（metal ion binding）、血紅素結合和蛋白激酶活性（protein kinase activity）亞類中，在金屬離子結合亞類富集的基因數量最多（圖3-B）。這些結果再次表明，提高抗氧化解毒能力可能是采后黃瓜耐冷性增強的重要原因。另外，較長時間的冷馴化處理可能激活了蛋白激酶活性，導致蛋白質構象和酶活性發(fā)生變化，從而更好地適應低溫環(huán)境。[FL）]

2.5 冷馴化處理72 h與12 h間的轉錄組差異

冷馴化處理72 h與12 h相比，72 h的冷馴化處理上調626個DEGs表達，下調1 192個DEGs表達，下調表達的DEGs多于上調表達 ?（圖4-A），表明持續(xù)的冷馴化處理抑制一些生物過程，避免物質過度消耗，以維持更長時間的生命活動。

在生物過程類別中，DEGs主要富集在氧化還原過程、轉錄調控和生長素激活的信號途徑（auxin-activated signaling pathway）3個亞類中。同樣，氧化還原過程亞類中富集的DEGs最多；在細胞組分類別中，膜中間組分富集了最多的DEGs；在分子功能類別中，DEGs主要富集在轉錄因子活性、血紅素結合和鐵離子結合3個亞類，轉錄因子活性亞類富集的基因數量最多（圖 ?4-B）。這些結果表明，經過持續(xù)的冷馴化處理，采后黃瓜的抗氧化解毒活性被強化，以應對持續(xù)的脅迫低溫對采后黃瓜造成的氧化損傷。[FL）]

2.6 冷馴化處理對氧化還原過程有關差異表達基因表達的影響

在生物過程分類中，由于氧化還原過程中富集的差異表達基因數量最多，表明氧化還原過程在冷馴化誘導的耐冷性中發(fā)揮重要作用。為此，重點分析了富集與氧化還原過程有關DEGs在冷馴化處理期間的表達模式。共有381個DEGs的功能與氧化還原過程有關，其表達模式總體分為3種類型。一些DEGs的表達被冷馴化處理持續(xù)誘導，表達量隨處理時間增加而增加（圖5）。比如CsaV3_1G011780基因，在0 h的表達量為 ?1.78，12 h的表達量為2.96，72 h的表達量為 ?19.05。一些DEGs只被特定時長的冷馴化處理所誘導（圖5）。比如CsaV3_3G012260基因只在處理12 h時被誘導表達，而CsaV3_7G030830基因只在72 h時被誘導表達。另一些DEGs被冷馴化處理所抑制，有些基因在12 h時抑制作用更強，有些在72 h時抑制作用更強（圖5）。比如CsaV3_2G017780基因在72 h的抑制作用強于12 h，而CsaV3_5G001900基因在12 h的抑制作用更強。這些結果表明，在冷馴化處理期間，與氧化還原過程有關基因的表達模式十分復雜，相關基因精準并特異地參與采后黃瓜適應低溫脅迫的過程。值得注意的是，上調表達的差異表達基因主要是活性氧清除酶編碼基因，比如抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽巰基轉移酶、超氧化物歧化酶和脯氨酸脫氫酶等，表明冷馴化處理提高了采后黃瓜的抗氧化解毒活性。

2.7 冷馴化處理對膜組分有關差異表達基因表達的影響

在細胞組分類別中，冷馴化處理導致的DEGs主要富集在細胞膜組分亞類中，表明冷馴化處理過程中膜組分發(fā)生了顯著變化。冷馴化誘導細胞膜組分改變，可能是采后黃瓜響應低溫信號并適應低溫脅迫的重要機制。為此，重點分析了冷馴化處理對膜組分有關DEGs表達模式的影響。共篩選出1 126個DEGs的功能與細胞膜組分有關，表達模式總體分為2種類型。一些基因的表達被冷馴化處理所誘導，另一些基因的表達被冷馴化處理抑制（圖6）。比如，CsaV3_1G027990基因在72 h的表達量顯著高于12 h 和0 h，且12 h的表達量高于0 h，而CsaV3_2G029640基因在0 h的表達量顯著高于12 h和72 h時。這些結果表明，冷馴化處理顯著影響細胞膜組分，在冷馴化處理期間，細胞膜組分會根據細胞所處環(huán)境不斷調整優(yōu)化，以更好地適應低溫脅迫。

2.8 響應冷馴化處理的轉錄因子鑒定

GO富集分析結果顯示，與轉錄調控有關的DEGs被顯著富集，表明冷馴化通過調節(jié)轉錄調控活性，被激活或抑制的轉錄因子，進一步調控下游耐冷相關基因表達（圖2-B～圖4-B）。為此，從DEGs中篩選了響應冷馴化處理的轉錄因子基因，并分析了主要轉錄因子家族基因在冷馴化處理過程中的表達模式。共有104個差異表達的轉錄因子基因響應冷馴化處理，主要是AP2/ERF、bZIP、WRKY、HSF、HKN、GATA等轉錄因子家族（圖7-A）。其中，38個是AP2/ERF家族基因，16個是bZIP家族基因，15個是WRKY家族基因，8個是HSF家族基因，7個是HKN家族基因，5個是GATA家族基因，ZAT、GRAS、MADS和MYB家族各有3個，CBF/NF-YA、E2F和bHLH家族各有1個（圖7-A）。其次，重點分析了AP2/ERF、bZIP、WRKY、HSF和HKN家族基因在冷馴化處理期間的表達模式。

冷馴化處理下調20個 ?AP2/ERF基因的表達。3個 AP2/ERF基因（CsaV3_4G003470、CsaV3_3G016760和CsaV3_5G004600）在12 h表達下調，卻在72 h時又表達上調。冷馴化處理顯著上調另外15個 AP2/ERF基因的表達 ?（圖7-B）。

12 h 和72 h的冷馴化處理顯著上調7個bZIP基因的表達。5個bZIP基因的表達只被12 h的冷馴化處理所誘導，而72 h的冷馴化處理卻抑制他們的表達。冷馴化處理顯著抑制其余4個bZIP基因的表達（圖7-C）。

冷馴化處理抑制2個WRKY基因（CsaV3_4G001260和CsaV3_6G051260）的表達，且72 h的抑制作用更強烈。4個WRKY基因的表達在冷馴化處理12 h時顯著上調，但在72 h時顯著下調。12 h 和72 h的冷馴化處理顯著上調其余9個WRKY基因的表達（圖7-D）。

共有8個HSF基因在冷馴化處理過程中差異表達。其中，CsaV3_2G002270基因在12 h時的表達量顯著高于0 h和72 h，CsaV3_2G025510基因在12 h時的表達量顯著低于0 h和72 h。冷馴化處理顯著下調2個HSF基因（CsaV3_2G 013880和CsaV3_3G012910）的表達，顯著上調另外4個HSF基因的表達（圖7-E）。

冷馴化處理共導致7個HKN基因的表達量發(fā)生顯著變化（圖7-F）。其中，12 h和72 h的冷馴化處理顯著下調2個HKN基因（CsaV3_1G032090和CsaV3_5G032330）的表達，顯著誘導CsaV3_3G026410基因的表達。另外4個HKN基因在處理12 h時表達上調，在72 h時表達顯著下調（圖7-F）。

這些結果說明，轉錄因子參與了冷馴化誘導的采后黃瓜耐冷性，且表達模式具有明顯的時空特異性特征。也進一步說明，轉錄因子之間緊密配合，相互協(xié)調，復雜地調控采后黃瓜耐冷性。

2.9 冷馴化誘導差異表達的轉錄因子互作分析

轉錄因子不僅可以單獨調控靶基因表達，且他們之間還可以相互作用，協(xié)同調控靶基因表達［33-34］。為探究冷馴化誘導的轉錄因子之間是否存在潛在的相互作用關系，在百邁客公司的在線云平臺（http：//www.biocloud.net/），預測了轉錄因子之間的相互作用。結果顯示，共發(fā)現7個轉錄因子之間可能存在相互作用關系。AAI5（abscisic acid-insensitive 5）（CsaV3_7G008500）與GAI1（gibberellin-inducible factor）（CsaV3_1G031060）互作（圖8）。ZAT9（zinc finger protein）（CsaV3_3G007370）與NF-YA9（nuclear transcription factor Y subunit A-9）（CsaV3_7G031020）、GATA8（GATA transcription factor 8）（CsaV3_6G036510）、GATA9（CsaV3_3G023720）互作（圖8）。GATA9與ZAT10（CsaV3_4G034970）之間也存在相互作用關系 ?（圖8）。由此可以看出，冷馴化誘導的轉錄因子之間存在相互作用關系，協(xié)同調控采后黃瓜耐冷性。是否其他轉錄因子之間還存在相互作用關系，仍需進一步分析驗證。

2.10 qRT-PCR驗證

為了驗證轉錄組測序數據的準確性和可靠性，隨機挑選9個差異表達基因，利用qRT-PCR法檢測在冷馴化處理期間的表達變化，結果如圖9所示。在轉錄組測序結果中， ?ER2和 MYB301的表達量在冷馴化處理12 h時急劇增加，72 h時又有所下降（圖9）。與0 h相比，在冷馴化處理12 h和72 h時， EI3、 ACO1、 ERF113、 MYB36和 MYB4的表達顯著上調， AS1和 ACS1的表達卻顯著下調（圖9）。qRT-PCR分析的結果顯示，9個代表性差異表達基因的表達模式與RNA-seq結果總體一致（圖9），表明轉錄組測序數據是可靠的。冷馴化處理誘導或抑制其表達，預示著它們在采后黃瓜耐冷性中可能具有重要的調控? ?作用。

3 討? 論

采后果蔬的壽命與貯藏環(huán)境溫度有關，貯藏溫度越高，貯藏壽命越短；相反，貯藏溫度越低，貯藏期越長［35］，但過低的貯藏溫度會引發(fā)冷害。采后黃瓜貯藏在10 ℃以下低溫，就會發(fā)生冷害［6］。在本研究中，采后黃瓜在10 ℃冷馴化處理72 h，再貯藏在5 ℃低溫，緩解了采后黃瓜冷害，與本課題組之前的研究結果一致［9，27］，再次證實冷馴化處理是有效控制冷藏黃瓜冷害的采后處理技術。

在冷馴化處理期間，許多DEGs的表達水平發(fā)生了顯著變化，且下調表達的DEGs數量明顯多于上調表達的差異表達基因數量，表明冷馴化抑制了一些代謝反應，避免采后黃瓜對低溫脅迫作出過度反應。GO富集結果顯示，DEGs主要富集在氧化還原過程、細胞膜中間組分和轉錄調控類別中，表明冷馴化通過改變細胞膜組分，調節(jié)氧化還原狀態(tài)和轉錄活性，復雜地協(xié)調相關防御途徑，最終誘導采后黃瓜產生系統(tǒng)抗冷性。這與在采后番茄和番木瓜中低溫處理誘導的主要GO通路類似［36-37］。

氧化還原動態(tài)平衡對植物正常生長發(fā)育至關重要［38］。在逆境脅迫條件下，植物組織內活性氧代謝伴隨著氧化還原狀態(tài)變化而變化，從而引起細胞內代謝和相關基因表達的改變，為適應新環(huán)境變化而作出代謝調整，達到新的氧化還原平衡［39］。相比于低溫脅迫，冷馴化是一種相對溫和的低溫處理［40］。本研究中，冷馴化處理顯著影響大量與氧化還原過程有關基因的表達，且特定基因的表達模式具有明顯的時空特異性，表明冷馴化處理通過調節(jié)冷藏黃瓜的氧化還原動態(tài)平衡，賦予采后黃瓜耐冷性，以更好地適應低溫脅迫。此外，冷馴化處理上調的與氧化還原過程有關的DEGs主要是活性氧清除酶編碼基因，表明冷馴化處理激活了冷藏黃瓜的抗氧化系統(tǒng)，提高了對活性氧自由基的清除能力，這可能是冷馴化誘導采后黃瓜耐冷性增強的重要原因之一，這些結果與本課題組之前的結果相互印證［9］。

細胞膜是細胞生命活動賴以延續(xù)的基礎，當植物發(fā)生冷害后，細胞膜選擇透過性增大，流動性降低［41］。本研究中，冷馴化處理的采后黃瓜，在脅迫低溫條件下貯藏時，相對電導率緩慢增加，表明冷馴化處理有助于維持細胞膜完整性，避免細胞膜透性增大而有毒物質大量滲漏，造成細胞中毒。冷馴化處理誘導的DEGs顯著富集在細胞膜組分分類中，表明細胞膜組分在冷馴化處理期間發(fā)生了顯著變化。在冷馴化處理過程中，細胞膜組分不斷調整優(yōu)化，從而維持細胞膜較高流動性和完整性，以適應更低的脅迫溫度。總之，冷馴化處理通過影響細胞膜組分相關基因的表達，保持細胞膜完整性和流動性，增強了冷藏黃瓜對低溫脅迫的耐受性，這與筆者之前的結果是一致的［9，23，27］。

許多研究表明， ?WRKY、 ?AP2/ERF、 ?bZIP、 ?HSF、 ?MYB等轉錄因子在調節(jié)植物低溫脅迫應答反應中起著重要調控作用［42-46］。本研究中，104個轉錄因子基因在冷馴化處理過程中表達發(fā)生了顯著變化。同一家族的轉錄因子基因在冷馴化處理期間的表達模式不同，表明特定轉錄因子特異性地調控采后黃瓜耐冷反應。許多轉錄因子基因表達被冷馴化處理誘導，表明這些轉錄因子與采后黃瓜耐冷性正相關。被冷馴化處理抑制表達的轉錄因子基因，可能負調控采后黃瓜耐冷性。HSF轉錄因子通常響應熱激處理，熱處理誘導的采后黃瓜耐冷性與HSF表達密切相關［47］。本研究中，冷馴化處理影響8個HSF基因的表達，表明除熱處理外，低溫處理也可誘導HSF表達，HSF表達可能與冷馴化誘導的采后黃瓜耐冷性密切相關。冷馴化誘導的轉錄因子之間還存在相互作用關系，表明轉錄因子之間可能通過相互作用形成復合體，協(xié)同調控冷藏黃瓜耐冷性。綜上，這些結果為耐受低溫脅迫的黃瓜新種質培育提供了重要基因資源。

4 結? 論

冷馴化處理誘導的差異表達基因主要富集在氧化還原過程、細胞膜中間組分和轉錄調控活性GO類別中，表明冷馴化處理通過調節(jié)采后黃瓜氧化還原活性和細胞膜組分，增強采后黃瓜耐冷性，以適應低溫脅迫。此外，許多 AP2/ERF、WRKY、bZIP、HSF等轉錄因子家族基因的表達在冷馴化處理期間發(fā)生了明顯變化，表明這些轉錄因子參與了采后黃瓜誘導耐冷性的調控，可在今后深入研究這些轉錄因子基因的功能。總之，本研究通過分析冷馴化處理期間的轉錄組學變化，從轉錄水平上闡述了冷馴化誘導采后黃瓜耐冷性的潛在機制。

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Transcriptomic Changes of Postharvest Cucumber during Cold Acclimation

Abstract Postharvest cucumber is a kind of cold-sensitive fruit vegetable，which is subjected to chilling injury during cold storage. The results of previous studies showed that cold acclimation treatment could induce the chilling tolerance of postharvest cucumber and reduce the occurrence of chilling injury. In order to explore the transcriptomic changes induced by cold acclimation，transcriptomic changes during cold acclimation were analyzed. Compared with that before storage （0 h），cold acclimation significantly affected the differential expression of 1 870 and 3 550 genes at 12 h and 72 h，respectively. The expression verification results of representative differentially expressed genes （DEGs） showed that the results obtained by qRT-PCR and RNA-seq were consistent in general，which conformed the accuracy and reliability of RNA-seq data. The results of GO enrichment analysis showed that the DEGs induced by cold acclimation were mainly enriched in three GO pathways： oxidation-reduction process，integral component of membrane and transcription factor activity，suggesting that cold acclimation enhanced the chilling tolerance of cucumber fruit by regulating oxidation-reduction status and cell membrane component. Further analysis showed that 104 transcription factor genes were responded to cold acclimation，and differentially expressed transcription factors were mainly ERF，bZIP，WRKY and HSF families，indicating that transcription regulation mediated by transcription factor played an important role in cold-acclimation-induced chilling tolerance in cucumber fruit. The results provide new insights into the induction of chilling tolerance in harvest cucumbers，and help to deepen the understanding of the molecular mechanisms of chilling tolerance induced by cold acclimation，and? ?identify important gene resources for the cultivation of cold-tolerant cucumber.

Key words Harvested cucumber; Chilling tolerance; Cold acclimation; Transcriptomic analysis; Transcriptional factor