內生真菌對宿主布頓大麥耐堿性的滲透調節和膜系統影響

任改香 陳水紅 王凱 特木爾布和

摘 要 為了研究帶內生真菌（E+）和不帶內生真菌（E-）布頓大麥（Hordeum bogdanii）的耐堿性，選擇來源于新疆阿克蘇溫宿縣的帶內生真菌（E+）和不帶內生真菌（E-）布頓大麥種子，先在培養皿中進行發芽，然后進行室內蛭石無土栽培，對其進行21 d的不同濃度混合堿脅迫處理，測定其滲透調節和膜系統變化。結果表明，在相同混合堿處理下， E-植株的相對電導率均顯著高于E+植株（P＜0.05），E+植株的細胞通透性弱于E-植株。在堿脅迫下E+植株的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著高于E-植株（P＜0.05）。內生真菌具有提高宿主滲透調節物質和降低膜損傷來提高布頓大麥抗堿的能力。

關鍵詞 內生真菌；布頓大麥；混合堿脅迫；滲透調劑；膜系統

布頓大麥（Hordeum bogdanii）是一種分布于甘肅、青海、內蒙古、新疆等高寒地區的荒漠和鹽漬土壤等逆境條件下生長的野生禾本科牧草[1]。布頓大麥在新疆分布比較廣，沿天山兩側的平原、綠洲、草地、鹽堿化草甸以及路邊都有其野生種的生長。該草的產量較高，草質柔軟、細嫩，適口性好，具有較強的抗寒、耐濕及鹽堿的性能[2]，在作為飼用牧草與改良荒漠土地及鹽堿地等生態環境方面具有很廣闊的前景[3]。

禾本科植物中的內生真菌類的研究工作首先是在歐洲進行的，1798年首先在瑞士燕麥族鴨茅屬植物（Dactylis glomerata）上找到子座，將該內生真菌類確定為E.typhina[4]。20世紀40年代開始，在新西蘭就針對導致牲畜食物中毒的黑麥草內生真菌展開研究[5]。接著世界各地展開禾草內生真菌的研究工作。近期研究發現，新疆地區野生布頓大麥保持較高的內生真菌侵染率[6]。

內生真菌（Endophytic fungi）是指生活史的全部或某一段時期生活在植物組織內部，且不引起植物組織發生明顯病害癥狀的一類真菌[7]。內生真菌在大自然中是普遍存在的，目前許多種禾本科植物中已經發現內生真菌。內生真菌類在禾本科植物體中會長久存活，和宿主一同發展的，而在植物進化過程中內生真菌類也與其宿主之間會產生禮尚往來共利的關系[8]。

中國擁有非常寶貴的禾本科牧草資源，但關于禾本科植物的內生真菌研究起步晚，研究報道少，從醉馬草（Achnatherum inebrians）、布頓大麥和阿拉套羊茅草（Festuca alatavica）中檢測到了內生真菌Neotyphodium[9-10]。國外有大量研究成果顯示內生菌對禾本科植物的侵染能夠提高植物的耐旱能力[11]、耐鹽性[12]，增加了植株自身的競爭力，抵抗雜草[13]，從而去影響植物的進化過程以及群落的演替，可以提高植物群落里物種的豐富度，有利于植物生態系統的可持續發展和環境的治理以及環境保護。

植株的耐鹽堿機理十分復雜，而其耐鹽堿機理的一個非常關鍵方面，就是在鹽分脅迫下植株內會形成并積累某些細胞有機滲透壓的調控產物，并借此來減少鹽堿脅迫對植株所造成的破壞和減少細胞內滲透壓位勢以保持在鹽分脅迫條件下水分的正常供給。這種化合物中主要含有可溶性葡萄糖、可溶性蛋白、脯氨酸及等[14]。膜系統也是植株鹽害的主要靶點，在植株遭受鹽害威脅時，作為主要靶點膜系統的對細菌細胞壁的破壞程度的高低可表現鹽害對植株的影響，因此鹽含量脅迫也會損害植株的膜防護體系[15]，而鹽含量脅迫也會使丙二醛（MDA）濃度進一步增加，葉片的電導率增加，因此膜破壞度進一步增加[16]。

為了研究內生真菌對布頓大麥的耐鹽堿機理，探討內生真菌在堿脅迫下對宿主滲透調節和膜系統的影響。本試驗采用帶內生真菌和不帶內生真菌的布頓大麥種子，對其無土培養，鹽堿處理一定時間后，取樣測定滲透調節和膜系統相關的理化指標，綜合分析并搞清楚內生真菌對其宿主的影響，結果可為后期的內生真菌研究和提高宿主滲透調節物質和膜系統的相關科學研究提供 ?參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采集于新疆阿克蘇地區溫宿縣境內的布頓大麥種子，種植后用苯胺藍染色法檢測內生真菌，并收集帶菌布頓大麥的種子，同時，將采集E+布頓大麥種子用10%甲基托布津浸泡 ?6? h，剔除種子內種皮及糊粉層中的內生真菌獲得不帶內生真菌（E-）的布頓大麥種子[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養 將布頓大麥E+和E-的種子在培養皿中發芽。于室內用蛭石無土法培養，小苗長出后移植于新疆阿拉爾市塔里木大學智能溫室（白天平均溫度28 ℃±2 ℃；夜間平均溫度12 ℃±2 ℃）。幼苗生長至3～4個分蘗時取分蘗葉鞘內表皮的薄層再次采用苯胺藍染色法依靠真菌形態學確認帶菌E+和不帶菌E-植株，同時移栽至花盆中（上：13 cm；下底：10 cm；高：12 cm），每周澆一次hoagland 營養液，每盆澆200 mL。

1.2.2 試驗處理 布頓大麥植株生長2個多月后檢菌確定E+與E-，分別用濃度為0 mmol/L（CK）、25 mmol/L、50 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L的混合堿（Na2CO3∶NaHCO3= ?1∶1）進行脅迫處理，每個處理6次重復，處理期間定期補充盆里減少的水分，處理21 d。

1.2.3 相關指標測定 MDA含量測定：參照李樹偉等[18]的硫代巴比妥酸（TBA）法；可溶性蛋白含量：采用考馬斯亮藍法[19]；可溶性糖測定：采用李合生[19]的蒽酮比色法；脯氨酸測定：采用張殿忠等[20]的磺基水楊酸法；細胞質膜透性測定：采用電導儀法[21]。

1.3 數據處理

采用Excel 2007軟件進行繪圖、用SPSS? ?23.0軟件進行數據分析，數據采用“平均值±標準誤”表示。采用雙因素方差分析方法檢測混合堿處理和布頓大麥內生真菌對不同生理指標的影響，其中不同混合堿處理濃度對布頓大麥生理指標的影響用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 內生真菌和堿對膜透性的影響

2.1.1 對MDA含量影響

在布頓大麥E-植株根內的MDA含量均高于E+植株（P＜0.05）（圖1-a）。莖中的MDA含量呈現出，E+植株小于E-植株，但差異不顯著（圖1-b）。葉片中的MDA含量也是E+植株小于E-植株（P＜ ?0.05）（圖1-c）。

2.1.2 對葉片相對電導率影響 在相同處理下，布頓大麥E-植株的相對電導率均顯著高于E+植株（P＜0.05），E+和E-植株的相對電導率在高于50 mmol/L以上的處理中，均高于對照CK和25 mmol/L處理（圖2）。

2.2 內生真菌和堿對滲透調節物質影響

2.2.1 對脯氨酸含量的影響 布頓大麥根的脯氨酸含量在相同處理下，E-植株的均小于E+植株，在CK、25 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L處理下，E-植株的脯氨酸含量顯著小于E+植株（P<0.05）（圖3-a）。在相同處理下， ?E+植株莖的脯氨酸含量均高于E-植株，除了200 mmol/L處理外，其余處理下，E-植株的脯氨酸含量均顯著低于E+植株（P<0.05）（圖 ?3-b）。E-植株葉片的脯氨酸含量均小于E+植株，在150 mmol/L、200? mmol/L處理下，E+植株葉片的脯氨酸含量顯著高于E-植株 ?（P＜0.05）（圖3-c）。

2.2.2 對可溶性糖含量的影響 可溶性糖含量在CK、150? mmol/L處理下，布頓大麥E-植株根的可溶性糖含量顯著低于E+植株（P＜ ?0.05），其余處理中，E+植株的可溶性糖含量均高于E-植株（圖4-a）。E-植株莖的可溶性糖含量均低于E+植株（P＜0.05）（圖4-b）。葉片的可溶性糖含量，在相同處理下，E-植株葉片的可溶性糖含量均低于E+植株，且在150 mmol/L處理下，E-植株葉片的可溶性糖含量顯著低于E+植株（P＜ ?0.05）（圖4-c）。

2.2.3 對可溶性蛋白含量的影響 在相同條件處理下，布頓大麥E-植株根的可溶性蛋白含量均低于E+植株（P＜0.05）（圖5-a）。在相同處理下，E-植株莖的可溶性蛋白含量均小于E+植株，而在25 mmol/L處理中，E+植株莖的可溶性蛋白顯著大于E-植株（P<0.05）（圖5-b）。在相同處理下，E-植株葉的可溶性蛋白含量均小于E+植株，但其中25 mmol/L和50 mmol/L處理中，E+植株可溶性蛋白含量顯著大于E-植株（P＜0.05）（圖5-c）。

3 討? 論

植物處于逆境當中，會對植物的各種反應機制形成脅迫，包括直接或者間接的堿脅迫，植株能夠通過集聚滲透調節物質的方式提高植物的抗堿能力，從而適應堿脅迫植物積累的物質涵蓋了脯氨酸、可溶性蛋白等，這些滲透調節物質為禾本科植物應對逆境脅迫提供了重要作用。本研究得出內生真菌對不同堿濃度脅迫的布頓大麥的滲透調節物質有顯著影響。

布頓大麥內生真菌對MDA含量具有顯著影響。在本試驗研究中，E-植株葉片細胞內MDA含量均高于E+植株，MDA含量強弱也是細胞膜脂過氧化功能好壞的關鍵指標之一，MDA含量越高則表明細胞質中存在著越強的滲透性物質。在強堿性脅迫下內生真菌對布頓大麥細胞膜滲透性是有重要影響的。本試驗研究結論表明，E+植株的細胞質滲透性弱于E-植株的，這一結論與王正鳳等[22]的關于內生真菌可減少野大麥植株細胞MDA含量的試驗研究結果完全 ?相符。

布頓大麥內生真菌對相對電導率有顯著影響。在相同處理條件下，E-植株的相對電導率顯著高于E+植株，鹽脅迫濃度越高細胞膜被損傷的程度越大，本試驗研究結果顯示，E+植株的葉片相對電導率維持在較低的水平，說明內生真菌通過降低相對電導率來保護布頓大麥細胞膜免受堿脅迫的傷害，維持了細胞膜的完整性，此試驗結果與宋梅玲[23]的內生真菌能降低鹽處理野大麥植株電解質滲透率的研究結果一致。

大量試驗研究結果表明，脯氨酸累積可以增加對滲透脅迫的耐性[24]。E-植株莖的脯氨酸含量顯著低于E+植株。當布頓大麥植株處于鹽脅迫的不良環境中時，會產生更多的脯氨酸來提高其抗鹽性，本試驗結果與施寵等人的內生真菌能提高鹽處理披堿草植株脯氨酸含量的研究結果一致[25]。

在鹽脅迫下的植株生長發育會遭到嚴重抑制，糖利用降低，同時植株葉片內的可溶性糖含量也提高了[26-27]。本試驗研究結果表明，E-植株葉片的可溶性糖含量均小于E+植株，這說明內生真菌能夠使植物的可溶性糖含量增加，這一結果與任安芝等[28]的內生真菌在高濃度鹽處理能降低黑麥草植株可溶性糖的研究結果相反，推斷此相反結果的理由是由于處理的鹽堿、植物種類和內生真菌不同而導致。

試驗結果中發現布頓大麥E-植株葉片的可溶性蛋白質含量均小于E+植株，這一結果與鮑根生等[29]的研究結果一致。可溶性蛋白也是重要的調節物質用來維持細胞滲透勢，當布頓大麥抵御外來酸堿脅迫的惡劣條件時，就會產生更多的可溶性蛋白來增強其耐堿性。

4 結? 論

混合堿的脅迫下，布頓大麥內真生菌通過減少其根、莖、葉中的MDA含量、葉片相對電導率，從而降低了混合堿對宿主膜質體系的破壞。通過增加宿主根、莖、葉片脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白質含量，來調整植物細胞的滲透壓。內生真菌具有提高宿主滲透調節物質和降低膜損傷來提高布頓大麥抗堿的能力。

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Effects of Endophytic Fungi on Osmotic Regulation and Membrane System

of Alkaline Tolerance in Host? Hordeum bogdanii Barley

Abstract This study aimed to investigate alkaline tolerance of ?Hordeum bogdanii barley， comparing plants with endophytic fungi （E+） and those without endophytic fungi （E-）. Seeds of alkaline-tolerant barley from Aksu Wensu County in Xinjiang were used as experimental materials. Initially，the seeds were germinated in petri dishes and then cultivated in vermiculite soilless conditions in a laboratory setting. Over a 21-day period， the changes in osmotic regulation and membrane system under treatments of different mixed alkali concentration were observed. The results showed that E-? plants exhibited significantly higher relative electrical conductivity compared to E+ plants when subjected to the same mixed alkali treatment （P<0.05）， indicating greater cell membrane damage in E-? plants.Conversely，the? E+ plants exhibited stronger cell permeability and higher levels of proline， soluble sugar， and soluble protein under alkali stress compared to E- plants （P<0.05）.In conclusion，Endophytic fungi play a role in enhancing the hosts osmotic regulation substances and reducing membrane damage，thereby improving alkali resistance of Hordeum bogdanii barley.

Key words Endophytic fungi; Hordeum bogdanii; Mixed alkali stress; Osmotic adjustment; Membrane system